【文献】甘蓝中的硬皮病诱导启动子 pBnGH17 D7：分离、鉴定及在宿主诱导基因沉默中的应用

参考文献：

Lin L, Fan J, Li P, Liu D, Ren S, Lin K, Fang Y, Lin C, Wang Y, Wu J. The Sclerotinia sclerotiorum-inducible promoter pBnGH17D7 in Brassica napus: isolation, characterization, and application in host-induced gene silencing. J Exp Bot. 2022 Nov 2;73(19):6663-6677. doi: 10.1093/jxb/erac328. PMID: 35927220; PMCID: PMC9629790.

 摘要

       由硬核菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的茎腐病（SSR）是全球范围内对甘蓝型油菜最具破坏性的病害之一。由于抗性种质资源有限，在甘蓝类作物中进行抗 SSR 的常规育种具有挑战性。因此，基因工程是开发抗 SSR 甘蓝作物的一种有吸引力的方法。与组成型启动子相比，硬核菌导型启动子可避免防御基因的异位表达，以免造成植物生长不良。在这项研究中，我们从油菜糖基水解酶 17 基因（pBnGH17）的启动子中生成了一个硬核病诱导启动子 pBnGH17D7。具体来说，在转基因拟南芥植株中进行的 5'-deletion 和启动子活性分析确定了 pBnGH17 的 189 bp 区域，该区域对于 S. sclerotiorum 诱导的反应是不可或缺的。与 pBnGH17 相比，pBnGH17D7 在 S. sclerotiorum 感染后表现出相似的反应，但在没有 S. sclerotiorum 感染的情况下，其在植物组织中的活性较低。此外，我们还发现转录因子 BnTGA7 可直接与 pBnGH17D7 中的 TGACG 基序结合，从而激活 BnGH17。最终，我们利用 pBnGH17D7 通过宿主诱导的基因沉默来设计抗硬皮病的油菜。它能在感染期间特异性地诱导针对 S. sclerotiorum 致病因子基因的 siRNA 的高表达，从而提高抗性。

材料方法

一、植物材料、非生物胁迫和植物激素处理以及硬粒菌接种

1、Brassica napus line J9712 白菜

2、渗透胁迫、冷胁迫、热胁迫和盐胁迫，以及过氧化氢（H2O2）和水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、乙醚膦（ETH）等激素处理，以及SS菌接种。

二、启动子分离和启动子：:GUS 载体构建

1、全长：upstream of the translation start codon of BnGH17 (BnaC01g21880D)

2、5‘删除：generated by PCR——D1 (–500 to –1), D2 (–848 to –1), and D3 (–1260 to –1)

3、中间删除：generated through splicing by the overlap extension PCR technique——D4 (–1784 to –1261 and –500 to –1), D5 (–1430 to –1261 and –500 to –1), D6 (–1784 to –1607 and –500 to –1), and D7 (–1615 to –1427 and –500 to –1)

3、突变：splicing by the overlap extension PCR technique was used to introduce three mutations in the TGACG motifs of D7 at loci –1423/–1427

4、表达载体和酶切位点：pBI101（promoter::GUS） at EcoRI and BamHI 

三、A. thaliana transformation and treatments

四、Histochemical GUS staining

五、Total RNA extraction and qRT-PCR analysis

六、Y1H assay

七、Dual-luciferase reporter gene assay

八、EMSA

九、由 pBnGH17D7 驱动的 S. sclerotiorum 内聚半乳糖醛酸酶基因（SsPG1）的宿主诱导基因沉默（HIGS）

HIGS原理：

        在真核细胞内，外源或内源的双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）或RNA形成的发夹结构被Dicer蛋白识别后，切割成21-24nt的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），随后siRNA和Argonaute（AGOs）蛋白结合形成RNA诱导沉默复合物（RISC）。RISC特异的识别细胞内同源的目的基因mRNA，并对其进行切割，从而干扰目的基因的表达。

        因此，在真核细胞内表达目的基因的dsRNA，或者将体外表达或合成的dsRNA或siRNA导入真核细胞，都可能沉默目的基因。

        类似的，如果在寄主植物细胞内表达靶向病原基因的dsRNA，就可以实现对病原基因的干扰，从而抑制病原菌的生长和扩展。

        HIGS技术以病原菌生长发育和参与致病的重要基因作为靶点，通过在寄主植物中表达与病原菌靶基因互补的RNA分子，再经植物细胞加工形成siRNA，当病原菌侵染寄主植物时，寄主植物能够将siRNA转运到病原菌细胞内，特异性识别病原菌靶基因的mRNA，导致其降解，从而干扰靶基因的转录和翻译，进而影响病原菌的正常生长发育，降低病害的发生发展

1、将启动子pBnGH17-D7克隆到载体pMDC83ihpRNAi中，酶切位点是PmeI and SpeI sites，目的是代替CaMV 35S启动子。

2、然后，通过同源重组将 SsPG1 的 381 bp CDS 片段（296-676 bp）以有义和反义方向（有义-内切-反义盒）克隆到载体中。

3、通过 农杆菌 介导的下胚轴转化将其转化到油菜品系 J9712 中。利用特异引物进行 PCR 检测，筛选出阳性的转基因油菜植株。本研究中使用的所有转基因油菜植株均来自 T2 代。

4、评估抗性

5、进行小 RNA 测序以确定 HIGS 转基因植物中靶基因特异性 siRNA 的表达。随机选择两个独立的转基因 T1 株系（每个处理三个植株）的硬粒菌和模拟接种叶片，混合后进行小 RNA 测序。

十、测定聚半乳糖醛酸酶（PG）活性

测定试剂盒：Polygalacturonase assay Kit (Solarbio, Beijing, China)

主要结果

结果1：在油菜中筛选硬核病诱导启动子

1、根据转录组筛选6个诱导最强的基因，包括一个富半胱氨酸分泌蛋白、抗原 5-、和致病相关 1 蛋白（CAP）编码基因（BnaC01g04530D）、两个 BnGH17 基因（BnaC01g21880D 和 BnaA01g17540D）以及三个豆科凝集素（BnLLP）基因（BnaA05g24230D、BnaCnng78710D 和 BnaC01g36130D）。

2、由于 BnaC01g04530D 在根中的超高表达水平，（TPM）值为 7558，因此未对其进行进后续分析

3、测定了 BnGH17（BnaC01g21880D）在各种胁迫条件和激素处理下的表达模式，发现 BnGH17 在渗透胁迫、冷胁迫、热胁迫、盐胁迫以及 H2O2、SA、MeJA、ABA 或 ETH 处理下均无明显诱导作用。因此，BnGH17 启动子被选为 S. sclerotiorum 潜在的诱导启动子，用于进一步分析。

结果2：BnGH17 启动子的分离和特征描述

1、1784 bp promoter fragment upstream of the translational start site of BnGH17 (BnaC01g21880D) was cloned

2、PlantCARE

3、拟南芥侵染GUS染色和qRTPCR看启动子组织特异性

4、此外，在用 S. sclerotiorum 处理过的 pBnGH17::GUS 转基因 A. thaliana 叶片上，12 hpi 时可见 GUS 染色模式，24 hpi 时更为明显。在这种情况下，qRT-PCR 检测到的 GUS 相对表达量也与 GUS 染色结果一致：与模拟接种对照组相比，GUS 的表达量在 12 hpi 增加了近 200 倍，在 24 hpi 增加了 400 倍。

5、相比之下，在模拟接种对照组的叶片上检测不到 GUS 活性。

6、检测了 H2O2、SA、MeJA 和 ETH 处理后 pBnGH17::GUS 转基因拟南芥中的 GUS 活性，qRT-PCR 结果表明，H2O2、SA、MeJA 或 ETH 处理均未诱导 BnGH17 的表达。

结果3：pBnGH17 在转基因拟南芥中的缺失分析

1、pBnGH17中位于-1615和-1427位置之间的189 bp启动子区域对硬菌感染反应性至关重要。

2、 在正常生长条件下，转基因连翘的莲座叶（图 3D）、花序（图 3F）、带有发育中种子的胚珠（图 3G）和茎（图 3H）中检测不到 D7 构建体的 GUS 活性。

结果4：BnTGA7 与 pBnGH17 中的 TGACG motif相互作用

 1、为了鉴定与 pBnGH17 相互作用以介导 S. sclerotiorum 诱导基因表达的推定转录调节因子，我们以 pBnGH17 的 -1615 至 -1427 区域（pBnGH17-1615 至 -1427）为诱饵， Y1H 试验中筛选了 A. thaliana TF 文库 ，获得1589 个 互作因子。在这一高通量 A. thaliana TF 筛选系统中分离出了 At1g77920（AtTGA7）和 At1g22070（AtTGA3）。然后，我们在油菜中克隆了 BnTGA7 和 BnTGA3 的全长 CDS。通过点对点 Y1H 试验，我们证实 BnTGA3（BnaC05g17700D）和 BnTGA7（BnaA07g33790D）都与 pBnGH17-1615 至 -1427 发生了相互作用。

为什么选择At1g77920（AtTGA7）和 At1g22070（AtTGA3）？

TGA7隶属于 TGA TF 家族的 TGA7 通过直接与 TGACG 矩阵结合来调控防御基因（如致病相关 1，PR1）的表达。

2、pBnGH17D7::LUC/p35S::REN和BnTGA7（而非BnTGA3）的共表达显著提高了LUC:REN的比率（图4B），表明BnTGA7激活了pBnGH17D7启动子驱动的体内转录。

3、EMSA：GST-BnTGA7 重组蛋白能够与含有 TGACG 基序的探针结合，而单独的 GST 蛋白则不起作用。加入未标记的野生型竞争者后，结合信号强度下降（图 4C）。当用突变探针替换标记探针时，结合完全消失（图 4C）。

4、将 pBnGH17D7 的 TGACG 基序突变为 AGGG，并将突变后的启动子片段 pBnGH17D7-Mut 与 GUS 基因融合（图 4D）。带 pBnGH17D7-Mut::GUS 融合基因的转基因 A. thaliana 株系在感染 S. sclerotiorum 后 GUS 活性完全消失（图 4D），进一步证实了 TGACG 基序是S.sclerotiorum 反应的核心基序的结论（图 4D）。

结果5：应用 pBnGH17-D7启动子改造抗硬皮病的油菜

1、HIGS表达使病原基因沉默。因此，我们进一步研究了 pBnGH17-D7启动子 是否能在 HIGS 转基因植株感染 Sclerotiorum 时诱导 siRNAs 的表达。将 SsPG1 的 HIGS 目标序列插入到含内含子发夹载体 pMDC83-ihpRNAi 中，生成 HIGS 构建体，该构建体由土霉素磷酸转移酶选择标记基因、pBnGH17D7 启动子、间隔序列（PDK 内含子）和萘胺酸合成酶终止子组成（图 5A）。

2、将 HIGS 构建体转化到油菜品系 J9712 中，获得了 5 株独立的 T0 阳性转基因植株。为了确定互补 siRNA 在 HIGS 转基因植株中的表达，在接种 S. sclerotiorum 或模拟接种 S. sclerotiorum 24 小时后收获两个转基因 T1 株系（RNAi-4 和 RNAi-7）的叶片混合用于小 RNA 测序。

3、在模拟接种样本中，只检测到 31 个来自 HIGS 构建的 siRNA，占该文库中检测到的所有小 RNA 的 0.0003%（图 5B）。然而，接种硬核菌后，HIGS 转基因植株中特异 siRNA 的丰度（54 341 条）大幅提高，占该文库中检测到的小 RNA 总数的 0.5234%（图 5B）。最丰富的 siRNA 长度为 21-24 nt（补充图 S5），分布在整个目的基因区域（图 5B）。因此，我们的数据支持 pBnGH17D7 只在 S. sclerotiorum 感染期间才会在 HIGS 转基因植株中引发特异 siRNA 的高表达。

4、接下来，我们通过子叶接种和脱落叶片接种评估 HIGS 转基因油菜对 S. sclerotiorum 的抗病性。子叶接种评估了 HIGS 转基因品系（T2）的 SSR 抗性。在约 24 hpi 时，J9712 子叶正面开始出现明显的水渍状病变，并很快扩展到背面；48 hpi 后症状变得更加严重（图 5C）。与此相反，真菌诱导的水浸病斑在 48 hpi 时只出现在大多数 HIGS 转基因品系子叶的正面（图 5C）。与 J9712 相比，转基因品系 RNAi-4 和 RNAi-7 子叶上的平均病斑面积减少了 51.8-58.2%（图 5D）。与 J9712 相比，RNAi-4 和 RNAi-7 在 48 hpi 时接种 S. sclerotiorum 的子叶上 SsPG1 的相对表达水平分别降低了 81.2% 和 78.1%（图 5E），表明这些 HIGS 转基因品系对 S. sclerotiorum 的抗性因目的基因沉默而增强。

 评述：

本文亮点是最后启动子在HIGS中的应用。以真菌的致病基因PG1为靶细胞，将RNAi载体导入植物中，则可以降低PG1表达降低，从而影响病原菌的正常生长发育，降低病害的发生发展。将pBnGH17-D7启动子替换35S启动子，则可以使植物只在收到病原体侵害时降低PG1表达。