文献阅读-FCER1G与透明细胞癌中巨噬细胞的浸润相关并且通过调节肿瘤免疫产生不良预后

FCER1G positive relates to macrophage infiltration in clear cell renal cell carcinoma and contributes to unfavorable prognosis by regulating tumor immunity

摘要

背景：肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages）TAMs在透明细胞癌中与患者不良的预后相关，但是ccRCC与TAMs之间的重要的分子标记物不是很清楚。
方法：采用TCGA-KIRC中的肿瘤组织以及临近肿瘤组织中的正常组织进行差异表达分析鉴定差异表达基因。通过分析差异表达基因之间的相关性以及常见的巨噬细胞标志物鉴定TAMs相关的基因。基因集富集分析用于预测TAMs相关基因的功能。上述的结果采用RNA表达谱的验证集CheckMate 025 study和来自350个样本进行免疫组织化学分析。KM生存曲线，Cox回归分析以及Harrell’s concordance index analysis来判断预后效应。
结果：在本篇研究中，我们使用了生物信息学的方法探究在ccRCC中TAMs相关的基因以及确定了5种与所有选择的巨噬细胞生物标志物强烈相关的基因：包括STAC3，LGALS9，TREM2，FCER1G，PILRA。其中，FCER1G在肿瘤组织中高表达并且对于接受Nivolumab治疗的ccRCC的患者具有较强的预后作用。但是，其对于Everolimus并没有显示预后的价值。我们仍然发现FCER1G的表达水平与T细胞的抑制作用有关。并且FCER1G联合巨噬细胞生物标志物CD68可以进行预后分层。基于ccRCC患者样本的免疫组化的分析，我们进一步验证了FCER1G或CD68在肿瘤组织中高表达并且两者具有相关性。在肿瘤组织中高表达CD68或FCER1G往往OS和PFS更短。患者高表达CD68或FCER1G预示着预后差。结合CD68以及FCER1G有助于判断相同的TNM分期患者的预后情况。
结论：高表达FCER1G与TAMs浸润以及T细胞活化和增殖的抑制相关。结合FCER1G的表达水平以及巨噬细胞的生物标志物CD68可能是有希望的术后预后指标。
关键词：肾透明细胞癌，生物信息学分析，肿瘤相关的巨噬细胞，FCER1G，预后，肿瘤微环境

背景

ccRCC的发病率已经随着常规影像学的检查的应用而逐渐增加。透明细胞肾细胞癌是RCC中最常见的病理学亚型，占到所有RCC病例中大约75%并且合大多数癌症的死亡相关。手术切除是局灶性ccRCC标准治疗的方法。尽管如此，仍然有25%-40%的患者在放射性的治疗之后发生。跟随疾病的进展到晚期的状态，患者依赖酪氨酸激酶抑制剂作为一线干预的措施，但是，对TKIs的耐受不可避免地在标准化治疗以后发生。因此，对于ccRCC中关键分子标志物的理解被迫切的需要来更加准确的评估术后的长期结果以及寻找更加持久的治疗方法。
最近，肿瘤免疫微环境已经吸引了相当一部分的研究，免疫抑制细胞的浸润是ccRCC改变治疗效果的标志。对于TKIs免疫检查点抑制剂的临床实验例如CheckMate 214 [5], CheckMate 9ER [6], Keynote-426 [7], and IMmotion 151 [8] 已经具有显著的临床益处。CheckMate 214临床实验更新了长达四年随访结果仍然展示出持久的功效，促使研究人员考虑靶向肿瘤免疫作为晚期ccRCC长期有效治疗的可能性。但是，相当一部分的话患者对ICI没有显著反应，表明了可能的机制仍然知之甚少。
肿瘤相关的巨噬细胞在表型和功能差异很大的ccRCC中是一种关键的免疫细胞亚群，它们通过多种机制起作用，以影响ICI和TKIs的治疗效果。包括促血管的生成，加速肿瘤细胞的生长以及抑制抗肿瘤免疫。我们先前报道过几种分子，例如SRY-box转录因子17（SOX17）以及gankyrin，可以调节TAMs的功能以便于促进ccRCC的进展。因此，靶向TAM是一种潜在的方法对于抗肿瘤以及利用TKIs和ICIs获得协同效应。为了去探寻TAMs和ccRCC相互影响的机制，**我们寻找是否存在其他关键分子是否控制这种疾病中TAM的生物学功能。**基于此目的，我们利用公共数据库TCGA-KIRC数据集预测巨噬细胞相关的分子标志物并且在临床研究中利用大样本数据集进行验证。

方法

生物信息学分析

使用R包“TCGAbiolinks’”下载TCGA-KIRC的数据集中538例肿瘤组织和72例正常组织（NATs）的RNA表达谱。使用“TCGAanalyze_Preprocessing”函数执行阵列强度相关性分析以删除异常值（cut-off correlation score: 0.6）。“TCGAtumor_purity”函数用于排除不合格的肿瘤样品（tumor purity level <60%）。使用GC-content method进行数据标准化。为了去获得更加严格的结果，基因平均表达水平低于25%的基因将会被排除。使用“limma”R包进行差异表达基因分析。对表达谱数据进行归一化（log（exp+1））|logFC| > 0.1以及adjusted p value < 1e-10被认为是显著差异表达基因。标注化的bulk RNA-seq以及ccRCC患者使用PD-1阻断剂治疗或mTOR抑制剂治疗的临床信息从CheckMate 025研究中获得。为了进行富集分析，差异表达基因被导入clusterProfile中进行GO和KEGG分析，p value < 0.05的基因被认为是显著富集的基因。基因集富集分析是为了鉴别显著富集的基因集。只有false discovery rate和nominal p value < 0.05的基因集被认为是显著的富集。

患者和标本

来自于上海长海医院的407名患者的RCC组织样本被纳入到该研究中。主要包含两种series：第一种为TMA-30，主要包括29例ccRCC样本（来自于先前的研究），在2010-2015年接受过手术的患者。在TAM-30的队列中所有的患者都通过电话随访证实疾病进展（复发/转移）或者癌症相关的死亡。TAM-30队列包括10例配对的样本和19例非配对的样本。对每个样本进行两次重复实验。对于另一个队列的样本（TMA-2022 NO.1-8）包含378个RCC样本，在2016-2018年接受过手术的患者，包含在八种TMAs，所有TMA-2022 NO.1-8队列的样本，321例样本进行过病理检查。TMA-2022 NO.1-8队列中包括270例配对的肿瘤组织和癌旁组织的样本和50例非配对的样本。321例样本中有266例样本进行了电话随访。临床数据统计在table1 (Additional table files show this in more detail (see Additional file 1 and 2)).

主要的结果为OS和PFS。OS被定义为是指从随机化开始至因癌症引起死亡的时间（对于死亡之前就已经失访的受试者，通常将最后一次随访时间计算为死亡时间）。PFS被定义为是指由随机至第一次发生疾病进展或因癌症死亡的时间。IHC阳性对照的样本是来自于上海长海病理科捐赠。所有试验Scientific Research Review and Investigation Committee of the Third Affiliated Hospital of the Second Military Medical University (ID:EHBHKY2020-K-026, approval date: August 17th, 2020 ), and written informed consent was provided by all patients.

IHC

按照前面说描述的进行免疫组化实验。简单来说：

• ccRCC TMA石蜡包埋的切片采用抗原提层程序进行预处理。
• CD68抗体使用PH=6.0的柠檬酸
• 针对FCER1G抗体，PH=9.0乙烯二胺四乙酸
• 山羊血清用于阻断非特异性结合
• 随后将载玻片用抗CD68抗体(#76437s, rabbit anti-human monoclonal, 1:400; Cell Signaling Technology)FCER1G抗体（ab151986, rabbit anti human polyclonal, 1:400; Abcam）和在4°孵育过夜。
• 采用辣根过氧化物酶结合二抗孵育在室温下孵育1h以后（ab205718, goat anti-rabbit IgG polyclonal, 1:2000; Abcam）
• 载玻片使用3,3’-diaminobenzidine染色三分钟。
• 细胞核使用苏木精染色
• 人的扁桃体和脾脏组织为阳性对照（结果中并没有展示）
• ccRCC组织二次孵育抗体作为阴性对照（结果没有展示）
• 所有的片子使用Hamamatsu扫描纳米变焦S60(日本滨松市)进行结果观察，并且在同一个显示器上使用NDP.view软件进行评估。
• 考虑到CD68和FCER1G都是细胞膜表面标志物，染色强度定义为染色强度定义为百分比由阳性细胞(0-100)增殖所覆盖的面积由给定区域的阳性细胞密度(0-3)。使用这一个标准，IHC评分为0-300，所有的载玻片由两个经验丰富的病理学家独立评估。他们计算平均IHC评分。使用Olympus microscope (model BX51)进行拍摄，使用Adobe Photoshop and Illustrator进行图像处理。

数据统计

• The two-tailed Student’s t-test和Wilcoxon test用于检测连续变量。
• The chi-squared test or Fisher’s exact test用于检测分类变量。
• 使用R包“survival”和“survminer”R包进行Kaplan–Meier生存分析。
• 使用“survival”R包进行单因素回归分析，当变量<0.05时纳入到多因素回归分析中去。
• 使用GraphPad Prism 7.00 software检测受试者工作特征曲线（ROC）用于获得cut-off值以及曲线下面积。
• 使用R包“survcomp”R包，通过Harrell的一致性指数分析计算分层和其他临床预后因素的预后准确性。
• 使用“foreign”以及“rms”R包，通过Nomogram分析建立风险预测模型
• 所有的统计方法均使用R软件和GraphPad Prism软件。

结果

identification of macrophage-related DEGs in ccRCC using TCGA-KIRC database

TCGA-IRC数据，包括538例肿瘤样本和72例NATs样本，使用“TCGAbiolinks” R包进行数据下载。数据预处理采用包中的TCGAtumor_purity函数，以小于<60%的tumor purity为标准剔除了167个肿瘤样本，其余数据用GC-content的方法进一步进行归一化。排除基因平均表达水平小于<25%的样本。在数据预处理之后，来自于363个肿瘤样本和72例NATs样本共13,125个基因使用“limma”R包进行差异表达基因分析。使用|logFC|>0.1和adjusted p value < e-10。共筛选出了3,323个在肿瘤组织和正常组织中的差异表达基因。(Fig. 1).

我们选择5个TMA相关的biomarkers进行标注（CD14, CD68, CD86, CD163, and colony stimulating factor 1 receptor [CSF1R])并且计算了DEGs Pearson’s correlation coefficient。因此，五种巨噬细胞标志物中每一种都产生了一组相关的DEGs。为了检测与TAMs密切相关的基因Pearson’s correlation coefficient> 0.4 and P-value < 1e-10被认为是与TAMs强相关的DEGs（An additional table file shows this inmore detail (see Additional file 3) 。韦恩图展示了与说选择的巨噬细胞相关的biomarker相关程度较高的5种候选的DEGs，包括（STAC3，LAGLS9，TREM2，FCER1G，PILRA）(Fig. 2A, B)

为了验证我们的发现，采用web-based tool TIMER2.0计算巨噬细胞浸润丰度

FCER1G was abundantly expressed in ccRCCand contributed to poor prognosis in patients receiving anti‑PD‑1 treatment

FCER1G and macrophage markers exerted a synergistic effect on predicting the survival of patients with ccRCC, and high FCER1G expression was related to suppression of T lymphocytes

Prognostic value of FCER1G and CD68 in retrospectively collected ccRCC samples

Combination of CD68 and FCER1G expression resulted in a better prognostic stratification in patients with ccRCC