10X空间转录组数据分析之空间细胞密度

hello，大家好，今天礼拜天，天津雾霾严重，呆在家里学习一下吧。今天给大家分享的是空间转录组的空间细胞密度的分析，这个分析非常重要，下面是一张展示图。

大家应该都有基本的常识，那就是组织是一个有序的细胞结构，细胞不会随机出现在组织的各个区域，而是严格按照空间位置进行分布，当然了，受到了周围细胞环境的很多影响，那么这个分析体现的就是细胞类型空间分布的有序性，那么疾病样本细胞类型的空间分布，则体现了疾病对细胞空间排布的影响，文章在Spatially-resolved transcriptomics analyses of invasive fronts in solid tumors,很好的方法，今天我们就来分享这个内容。

Abstract

实体瘤是复杂的生态系统，异质性是克服肿瘤复发和转移的主要挑战。揭示肿瘤中细胞类型和功能状态的空间异质性对于开发有效的治疗方法至关重要，尤其是在肿瘤的侵袭前沿，即肿瘤细胞浸润和侵袭最活跃的区域。作者首先使用具有纳米级分辨率的 Spatial 增强分辨率组学测序（Stereo-seq，空间技术分辨率优于10X）来表征肝内胆管癌（ICC）的肿瘤微环境。在以肿瘤边界两侧为中心的 500μm 宽区域（即肿瘤的侵袭前沿）中发现了独特免疫细胞的富集、抑制性免疫微环境和肿瘤细胞的代谢重编程。此外，发现肝细胞的损伤状态在侵袭性前沿中过度表达血清淀粉样蛋白 A（SAA），募集巨噬细胞以促进进一步的肿瘤侵袭，从而导致更差的预后。还在肝细胞癌和其他肝转移癌中证实了这些发现。这样的分析突出了高分辨率空间解析转录组学方法的显著潜力，为全面剖析肿瘤生态系统和指导实体瘤新治疗策略的开发提供了有意义的生物学见解。

Introduction

实体瘤是复杂的器官样结构，往往会扩散到附近的组织并通过淋巴系统和血流转移到远处的器官。 有证据表明，实体肿瘤是具有高度异质性的复杂生态系统，涉及癌细胞与免疫细胞和基质细胞等各种细胞类型以及细胞外基质（ECM）成分相互作用的区域。 具体来说，肿瘤浸润边缘区域，肿瘤细胞侵入paranormal tissues并遇到各种各样的基质细胞和 ECM 成分，这是肿瘤细胞浸润和侵袭最活跃的区域。 全面了解该领域的成分及其空间异质性，以及肿瘤细胞与肿瘤微环境 (TME) 之间的相互作用，将有助于了解肿瘤侵袭和转移、评估预后并探索实体瘤的新治疗方法。

单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 是在单细胞水平上研究细胞成分及其相互作用的强大工具，已被用于表征多种类型实体瘤的 TME。然而，空间信息的缺乏是研究局部环境、特定细胞间相互作用和肿瘤进展之间的相关性的主要障碍，尤其是在肿瘤浸润边缘区域。此外，由于先前研究中缺乏多区域采样，单细胞分辨率的肿瘤内空间异质性仍然很差。最近开发的空间转录组学 (ST) 方法使用空间条形码寡聚脱氧胸苷微阵列促进了整个组织切片上转录物的无偏映射。然而，在以前的研究中应用的大多数 ST 方法的分辨率都很低，可以识别与数十个细胞而不是单个细胞混合的斑点。最近，将 DNA 纳米球 (DNB) 图案化阵列芯片和原位 RNA 捕获相结合，开发了具有纳米级分辨率 (220 nm × 220 nm/spot) 和可扩展区域 (10 mm × 10 毫米），每个单元捕获数百个数据点。因此，立体 seq 可以潜在地弥合 scRNA seq 和 ST 分析之间的差距，它们一起可以更好地表征整个肿瘤生态系统的功能和结构研究。因此，Stereo-seq 从肿瘤多区域组织中产生的单细胞和高维空间数据的整合将促进全面和无偏见的组织分析，以识别实体瘤中的肿瘤内异质性和 TME 细胞通讯，特别是对于肿瘤浸润边缘区域（空间技术倒是不错，分析方法都是通用的）。

肝癌是全球最恶性的实体瘤之一，而肝内胆管癌 (ICC) 是第二大最常见的原发性肝癌，在过去几十年中全球发病率不断增加。 然而，大多数患者 (> 70%) 在由于局部晚期或转移性疾病不能手术治疗的诊断时间。在这项研究中，作者使用具有高分辨率和厘米级视野的立体序列来表征肿瘤生态系统的复杂性和异质性，以及它们在 ICC 中的细胞相互作用，通过分析四个区域位点，包括肿瘤组织 (T) 、边缘区域 (B)、邻近正常组织 (P) 和正常或转移淋巴结 (LN)。通过将 ST 数据与 scRNA-seq 数据整合并使用生物信息学分析，分析方法确定了肿瘤侵袭前沿的高度细胞和转录异质性，其中肿瘤细胞侵入paranormal tissues。研究发现免疫逃逸能力增加，肿瘤细胞脂肪代谢增加，免疫细胞积累增加，尤其是在距肿瘤正常边界 250 µm 以内的区域。此外，发现靠近侵袭前沿的肝细胞中 SAA1 和 SAA2 的表达增加，这与巨噬细胞局部募集的增加有关，并与 ICC 患者的预后较差相关。此外，在其他四个额外队列中证实了这些发现在原发性和转移性肝癌中。作者的研究强调了高分辨率、空间分辨转录组学方法在为实体瘤新治疗策略的开发提供有意义的生物学见解方面的重要潜力。

Results

(1)Spatial resolved transcriptomics profiles of multi-regional tissues from ICC patients

为了表征 ICC 的空间转录景观，使用高分辨率（220 nm × 220 nm/点）和可扩展的立体序列处理来自瘤内组织、邻近正常组织、边缘区域和正常或转移淋巴结的新鲜冷冻组织 区域（10 mm × 10 mm）（下图）。 从病理诊断为 ICC（LC0、LC1、LC2、LC4、LC5、LC6、LC7）的 8 名患者的 27 个样本（T，6；B，8；P，7；LN，6）中生成了 50 张切片的立体序列数据 , 和 LC8) 使用相邻载玻片的苏木精和伊红 (H&E) 染色。

• 注：Schematic diagram of the spatial transcriptomics acquisition workflow based on 27 samples (T, 6; B, 8; P, 7; LN, 6) from eight patients with ICC with further data analysis. Liver cancers* include ICC (n = 10), HCC (n = 5), liver metastasis of colorectal cancer (n = 3), pancreatic cancer (n = 2), and lung cancer (n = 1).

. In the Discovery Cohort，从患者 LC5（604 个细胞）边缘区域组织生成的 scRNA-seq 数据与最近发布的 ICC scRNA-seq 数据集相结合，以建立细胞类型的参考表达图谱，以描绘每个组织切片中细胞类型群体的空间断层扫描 . 结果，使用 Seurat 将 29,793 个合格细胞聚集成 11 个主要细胞类型，包括 T 细胞 (CD3D)、自然杀伤细胞 (NKs) (KLRF1)、B 细胞 (MS4A1)、浆细胞 (MZB1)、巨噬细胞 (CD163/ CD14)、树突状细胞 (DC) (CD1C)、胆管细胞/胆管癌细胞 (KRT19/EPCAM)、肝细胞 (ALB)、内皮细胞 (CDH5/ENG) 和成纤维细胞 (ACTA2)。

对于 ST，每个 DNB 或 bin (220 nm × 220 nm) 检测到 2~90 个（中位数为 8 个）转录本，每个肝细胞（直径为 25~30 µm）大约有 2,500 个（50 × 50）个 bin 每个胆管癌细胞（直径为 15 µm）约 900 (30 × 30) 个 bin

• 注：Spatial transcriptomics (ST) spots were mapped to H&E staining of adjacent slides of LC4-T, and the raw spatial expression matrix with each bin/spot was convoluted into pseudo5 spots with 2.5 µm squares (5 × 5 bins/spot) to show unique molecular identifiers (UMI) counts of the cell nucleus (with a diameter of 15 µm) of a tumor cell by ST spots.

为了使用这些reference signatures进行空间细胞类型注释，原始空间表达矩阵被转换为 25 µm 平方大小（50 × 50 bins/spot）的SPot，大约代表一个细胞，平均 718 个基因和 1,644 每个spot检测到的 mRNA 分子。

• 注：Violin plots showing UMI counts (d) and numbers of genes (e) captured in 50 ST slides of 27 samples (T, n = 6; P, n = 7; B, n = 8; LN, n =6) from eight patients with ICC.

ST 载玻片中每个spot的细胞成分（50 × 50 bins/spot, 25 µm squares）由 SPOTlight （关于SPOTlight，大家可以参考文章SPOTlight助力单细胞和空间转录组联合分析）使用 scRNA-seq 作为参考确定，然后在空间点中注释 11 种主要细胞类型。

将每个spot分配给显示最高概率比例的特定细胞类型，因为第一个概率远高于第二个概率(这个注释在空间分析中很常见)。

经典细胞类型标记基因在定义的细胞簇中明显更高的表达支持了 ST 点细胞类型注释的合理性

（2）The heterogeneities of cell and ECM compositions as well as spatial distributions in multi-regions of ICC

ICC 患者的四个区域位点（T、P、B 和 LN）的细胞组成和空间分布高度异质。 不同区域在空间上具有不同的组织结构，由不同的主要细胞成分组成。 在肿瘤组织中，成纤维细胞、巨噬细胞和 B 细胞是最丰富的细胞，几乎占所有细胞成分的一半

• 注： (a) Pie graphs showing the percentages of major cell types in all cell components at four regional sites (T, n = 6; P, n = 7; B, n = 8; LN, n = 6) of eight patients with ICC. (b) H&E staining and heat maps of the spatial distributions of fibroblasts, T/NK cells, and B cells in four regional sites.

具体而言，在肿瘤组织中检测到的成纤维细胞百分比高于其他三个区域，这意味着 ICC 肿瘤组织的高度促纤维化特性。 正如预期的那样，肝细胞是邻近正常组织中的主要细胞类型，其次是胆管细胞和 B 细胞。对于边缘区域，除了肿瘤细胞和肝细胞外，成纤维细胞、B 细胞和巨噬细胞是最丰富的细胞类型。在LNs中，B细胞、T/NK细胞和巨噬细胞是最丰富的免疫细胞类型，B细胞广泛分布在整个LN组织中。 与正常 LN 不同，在 LC4-LN（有 LN 转移）中，肿瘤细胞覆盖了玻片中几乎一半的 LN 区域，而 B 细胞覆盖了其余的正常区域。此外，在 T、P 和 B 中也检测到由非淋巴组织中 DC、T/NK 和 B 细胞共聚集产生的典型三级淋巴结构 (TLS)，这通过 H&E 染色进一步证实

• 注：The three-dimensional diagram and corresponding heat maps showing tertiary lymphoid structures (TLS) where DCs,T/NK, and B cells co-aggregated

   

  

• 注：H&E staining and corresponding heat maps illustrating the location of tertiary lymphoid structures (TLS) featured with co-aggregation of B cells, T/NK cells, and DCs in LC6-B

此外，几种细胞类型在具有高空间异质性的不同组织区域中表现出不同的富集。Most of the fibroblasts in tumor tissues showed matrix cancer-associated fibroblast (mCAF) signatures with increased expressions of ECM related genes (LUM, DCN, and COL3A1), while more antigen presenting cancer-associated fibroblasts (AP-CAF) and inflammatory cancer-associated fibroblasts (iCAF) were found in adjacent normal tissues。

与邻近的正常组织相比，肿瘤组织和边缘区域中耗尽和细胞毒性 T 细胞之间的比率更高，表明 T 细胞的抑制状态和随后的 TME 中的癌症免疫逃避。 将 T 细胞和 B 细胞细分为不同的亚群后，在 LN 中观察到的初始 T 和初始 B 细胞的百分比显着增加，并且空间初始 B 细胞主要被浆 B 细胞包围。在空间细胞类型图中也鉴定了以被 B 细胞包围的 DC 聚集为特征的Germinal centers

• 注：The H&E staining, cell type spatial maps and corresponding IF illustrating the structure of the lymph node including the germinal center and the distribution of subpopulations of main cell types in lymph nodes (LC7-LN).

除了成纤维细胞cluster和免疫细胞在不同部位的空间异质性分布外，肿瘤细胞在不同瘤内区域也表现出明显的癌症特征富集，表明不同组织之间以及肿瘤组织内的空间异质性。

TME 由肿瘤细胞和 ECM 之间通过细胞-基质相互作用和 ECM 重塑的双向通信动态塑造。 为了全面了解四个regional sites之间的 ECM 重构和细胞-基质相互作用，启动了区域分割（1000 × 1000 bins 或 500 µm × 500 µm 每个点）以obtain approximately 400 spots of local bulk RNA profiles on each ST slide。 根据 ECM 相关基因和趋化因子/细胞因子基因的转录特征，从 48 张载玻片中捕获的总共 20,400 个 ST spot被分成 10 个模式。

• 注：Heat map showing the clustering of ECM components according to differentially-expressed genes in segmented spots. Different patterns, tissues and patients are labeled by colors

从不同患者收集的同一部位的分段 ST spot通过uniform manifold approximation and projection (UMAP) 进行可视化，表明特定部位的 ECM 和趋化因子/细胞因子富集的微环境。在肿瘤组织中，鉴定出HIF1A、CXCL6、IL18和MMP14等几个高表达基因。基于 scRNA-seq 数据，MMP14 可通过降解基质屏障和增强血管生成促进肿瘤生长和侵袭，被确定为肿瘤中最富集的 MMP，主要由成纤维细胞和肿瘤细胞分泌。此外，IL18 编码促进肿瘤进展的促炎细胞因子，在肿瘤中含量最高，主要由 DC、巨噬细胞和肿瘤细胞产生。在邻近的正常组织中，与其他三个区域相比，包括 IL6R、IL1RAP 和 CXCL2 在内的 ECM 成分高表达。 发现趋化因子或细胞因子簇（包括 CXCL8 和 CXCL1）的表达主要在边缘区域富集，表明这些区域有强烈的炎症反应。具体而言，根据 scRNA-seq 数据，编码炎症反应的主要介质的 CXCL8 主要由髓细胞分泌，包括巨噬细胞和中性粒细胞。此外，与其他三个区域相比，CCL19/CCL21 及其受体 CCR7 在 LN 中的表达最为丰富，支持 CCL19/CCL21-CCR7 轴在指导淋巴细胞归巢和组织免疫和炎症反应中的关键作用。此外，共刺激分子相关基因（CD28 和 CD80）的表达，它们是 T 细胞扩增、存活和激活中最重要的分子，以及抑制分子相关基因（CTLA4、BTLA、TIGIT、CD96、CD274 和 LGALS9 ) 在 T 细胞失活中至关重要，都在 LN 中特异性积累，表明双向和平衡的免疫调节。

• 注：H&E staining and heat maps of the spatial expression of inhibitory related genes BTLA, TIGIT, CTLA4, CD96, and CD274 in corresponding slide of LC5-LN.

（3）Enrichment of distinctive immune cells, the suppressive immune microenvironment, and metabolic reprogramming of tumor cells at invasive fronts

边界线周围的区域，肿瘤细胞侵入超自然组织并与各种基质细胞和 ECM 成分直接接触，已被认为是一个复杂的生态系统和实体瘤最重要的区域，用于了解肿瘤进展、免疫监视 , 侵犯正常组织。四个不同区域的细胞和 ECM 成分的转录景观也表明边缘区域炎症趋化因子/细胞因子的富集。研究观察到巨噬细胞和 NK/T 细胞在边界附近的积累，其中肿瘤细胞与相邻的肝组织直接接触，包括复杂的边界微环境

因此，为了进一步表征侵袭性肿瘤细胞前沿的微环境，使用六层构建了一个精确分割侵袭性肿瘤前沿周围边缘区域的模型（每层是一个距离横向边界线宽度为 250 µm 的区域）。 方向，每层沿边界线的轴向等分100等份）为双侧。

• 注：Schematic diagram of the identification of borderlines and segmentation of margin areas to characterize the spatial heterogeneity of margin areas. Three layers with a width of 250 µm were drawn from the normal side and from the tumor side of the borderline, respectively,and each layer was divided into 100 subregions along the borderline

首先根据ST载玻片中肿瘤细胞和肝细胞的空间分布拟合边缘区域的侵袭边界线，并通过相应相邻载玻片的H＆E染色证实，然后分析正常六层细胞成分的分数和特征和边缘的肿瘤slides。发现免疫细胞从肿瘤侧向边界周围区域募集，其轴向异质性高，尤其在靠近边界的 250 µm 宽区域富集，revealing the high heterogeneities of immune cell distributions around the borderline in both the axial and lateral directions

此外，发现成纤维细胞在肿瘤侧富集，但在肿瘤侧不同层之间的分数没有明显变化。在免疫细胞中，巨噬细胞、DC、T/NK 细胞和 B 细胞被发现在靠近肿瘤侧边界的区域更丰富。Moreover, the abundance of macrophages was found to be increased from the third layer (750-500 µm) and the second layer (500-250 µm) to the first layer (250-0 µm) in the tumor sides of the borderlines, while there was no change in adjacent normal tissues, further validated by IF result from 10 ICC patients from Validation Cohort 1 。观察到抗炎巨噬细胞（M2 样）而不是促炎巨噬细胞（M1 样）的百分比显着增加从外两层（750-500 µm 和 500-250 µm）到第一层（250- 0 µm) 靠近肿瘤两侧的边界线

DCs 和 T/NK 细胞的百分比从第三层（750-500 µm）增加到靠近肿瘤侧面边界的第一层（250-0 µm），而 B 细胞的百分比从第二层增加到第一层。T 细胞亚型，包括细胞毒性和耗竭的 T 细胞，分散在边缘区域中，边缘周围没有任何积累。然而，BTLA、CTLA4、CD96、IDO1等免疫检查点基因的表达在边界线的肿瘤侧富集，表明肿瘤侧靠近边界线区域的免疫细胞处于抑制性免疫状态!

相应地，与肿瘤侧外层的肿瘤细胞相比，第一层的肿瘤细胞显示出增强的免疫逃避特征

总之，这些结果显示了不同的 TME 特征，其中免疫细胞富集，包括巨噬细胞（M2 样）、T/NK 细胞、DCs 细胞和来自肿瘤侧的第一层（250-0 µm）的 B 细胞以及 在靠近入侵前沿边界的两侧最近的层中具有更强的免疫抑制性微环境。

除了免疫细胞分布的空间异质性和侵袭前沿的不同免疫抑制微环境外，我们进一步表征了边界线周围细胞成分（主要由肝细胞组成）的代谢变化和增殖能力。 一般来说，与边界线旁肿瘤侧的所有细胞相比，肿瘤侧的肿瘤细胞表现出较低的缺氧相关途径和较高的糖酵解水平

与相应的外部区域相比，与边界线最近的双侧层显示出更高的缺氧相关通路激活。与缺氧水平趋势一致，交界旁肿瘤旁第一层细胞糖酵解水平明显高于外层。Although there was no difference in glycolysis levels of tumor cells among different layers, upregulated levels of tricarboxylic acid cycle and fatty acid metabolism components, including fatty acyl CoA synthesis and fatty acid beta-oxidation of tumor cells, was found in the first layer, when compared with those in outer areas from the tumor side。这可能表明，由于进一步侵袭需要额外的能量，第一层中的肿瘤细胞经历了代谢重编程以上调脂质代谢。 正如预期的那样，与肿瘤旁侧的细胞（主要由肝细胞组成）相比，边界线肿瘤侧的肿瘤细胞表现出更高的 G2M 评分，表明肿瘤细胞具有更高的增殖能力。除了较高的增殖能力外，与边界线旁瘤侧的外部区域相比，在最接近的层中还检测到更高的细胞凋亡水平，这可能反映了靠近肿瘤旁边界线的肝细胞的严重受损状态 . 对于肿瘤细胞，在最接近的层中凋亡水平较高，但从侵袭前沿的肿瘤侧观察到不同层的增殖能力没有差异。在副肿瘤侧的第一层也发现细胞（主要由肝细胞组成）中更高水平的缺氧、糖酵解、增殖能力和凋亡。 因此，我们将以边界线为中心的 500 µm 宽区域定义为“侵入前沿”，这比之前定义的以边界线为中心的 1,000 µm 宽区域更合理。 综上所述，这些结果表明肿瘤细胞中脂肪酸代谢的能量供应增强，并且在靠近边界的区域中发现了占主导地位的抑制性免疫环境，尤其是在侵袭前沿。

（4）The damaged states of hepatocytes at invasive fronts were related to the prognoses of patients with primary and metastatic liver cancers.

除了代谢重编程现象和肿瘤细胞在侵袭前沿的免疫逃逸特征增强外，侵袭前沿的细胞成分（主要由肝细胞组成）也表现出增殖能力增强和细胞凋亡增加。 一些研究报道了肝细胞的炎症反应导致肝癌或肝转移。 为了表征细胞成分的炎症反应并在肿瘤侵袭期间识别不同的细胞簇，我们根据其在侵袭前沿的副肿瘤侧的三层（0-750 µm 宽区域）中的基因表达谱重新聚集肝细胞。 我们根据不同的基因表达谱确定了两种肝细胞亚型（Hep1 和 Hep2），其中 Hep1 细胞的 SAA1（急性期蛋白血清淀粉样蛋白 A1）和 SAA2（血清淀粉样蛋白 A2）的表达水平显着高于 Hep2 细胞。

• 注：Volcano plot showing differentially-expressed genes between Hep1 and Hep2. The red dots represent genes upregulated in Hep1 cells and the blue dots represent genes upregulated in Hep2 cells

关于它们的空间分布，Hep1 细胞主要聚集在第一层，靠近边界线的宽度为 250 µm，揭示了肝细胞由于直接暴露于肿瘤侵袭而严重受损的状态，这一点使用 IF 得到证实

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The bulk RNA-seq data from Validation Cohort 2 also showed much higher expression levels of SAA1 and SAA2 around the border areas (bilateral sampling of tissues with a width of 5 mm along the borderline) than corresponding tumor tissues and adjacent normal tissues。此外，来自另外 93 名 ICC 患者（验证队列 3）的 IHC 结果也显示在侵袭性前沿的 SAA 表达高于肿瘤组织或邻近正常组织外部区域的 SAA 表达

使用基因富集分析，与 Hep2 细胞相比，在 Hep1 细胞中还鉴定了包括氧化磷酸化、MYC 靶向 V1 和上调基因的上皮间质转化 (EMT) 在内的富集途径。与 Hep2 细胞相比，单细胞调节网络推理和聚类 (SCENIC) 分析还确定了不同的上调转录因子 (TF)，包括 Hep1 细胞中的 CEBPG、YY1、ETV6、CDX1 和 CTCFL

在这些TF中，ETV6、CEBPG、YY1和BHLHE40在SCENIC中被注释为SAA1和SAA2的潜在TF，表明靠近侵入前沿的第一层活动得分增加，这可能参与介导了SAA1的高表达 Hep1 细胞中的 SAA2

• 注：The TF activity scores of ETV6, CEBPG, YY1, and BHLHE40 in hepatocytes at invasive fronts in ST sides (LC5-B).

另一方面，根据 scRNA-seq 数据，报道的 SAA 受体基因，包括 FPR1、FPR2、TLR4、TLR2、SCARB1 和 CD36，主要在巨噬细胞中富集，这也得到了 ST slides结果的证实。

此外，表达编码 SAA 受体基因的巨噬细胞斑点和 Hep1 细胞在侵袭前沿在空间上积累，进一步表明巨噬细胞在侵袭前沿从肝细胞分泌 SAA

The accumulation of FPR1+ macrophages close to SAA+ hepatocytes at invasive fronts was further confirmed by multiplexed IF in Validation Cohort 1, including ICC (n = 10), HCC (n = 5), liver metastasis of colorectal cancer (n = 3), liver metastasis of pancreatic cancer (n = 2), and liver metastasis of lung cancer (n=1)

具体而言，在包括 ICC 和 HCC 在内的原发性肝癌以及上述转移性肝癌中，发现肿瘤侧 FPR1+ 巨噬细胞数量显着增加，侵袭前沿旁肿瘤侧的 SAA+ 肝细胞数量显着增加.

还观察到巨噬细胞富集与 SAA+ 肝细胞在侵袭前沿之间的强相关性（R = 0.73，P = 0.017）.此外，沿着正常肿瘤边界的侵袭前沿也存在高度异质性。 我们发现靠近 SAA 富集区域的肿瘤细胞表现出增强的 EMT、上调能量代谢过程（ATP 代谢过程、氧化磷酸化和呼吸电子传递链）和激活的免疫反应（干扰素 α 反应和 IL2-STAT5 信号传导） ) 与附近肿瘤细胞 Hep1 非富集 (Hep2 富集) 区域的侵袭性前沿相比.Finally, the damaged states of hepatocytes at invasive fronts were found to be related to the prognoses of patients with primary liver cancers. The higher expressions of SAA1 and SAA2 in the border areas from Validation Cohort 2 were significantly associated with worse overall survival (OS) of ICC patients (P = 0.019 for SAA1 and P = 0.019 for SAA2).IHC results from 93 ICC patients (Validation Cohort 3) also showed significant negative correlations between SAA expression levels at invasive fronts and the OS, as well as relapse-free survival (RFS) for ICC patients.这些结果表明肝细胞的受损状态与肿瘤进展以及患者的预后有关。 最重要的是，我们确定了肝细胞的受损状态，其特征在于响应于肿瘤侵袭的 SAA 过表达，随后募集巨噬细胞以进一步侵袭肿瘤，最终导致更差的预后。

Discussion

在这项研究中，将亚细胞分辨率的空间分辨转录组学与 scRNA-seq 相结合，以绘制来自 8 名 ICC 患者的四个区域位点的转录结构图。与其他 ST 方法相比，我们的 Stereo-seq 数据具有前所未有的纳米级分辨率（220 nm × 220 nm/点）和可扩展区域（10 mm × 10 mm），能够更准确地原位研究细胞类型或细胞状态，并且空间分割和进一步分析的更多空间。在我们的研究中使用 Stereo-seq 能够识别 ICC 患者不同区域的细胞类型和 ECM 成分分布。结果证实了细胞和ECM的组成异质性，以及它们在不同区域之间的空间分布。通过构建肿瘤边缘区域周围区域的分割模型，我们首先确定了侵袭前沿周围区域（以边界为中心的 500 µm 宽区域）中免疫细胞簇的独特富集、肿瘤细胞的代谢重编程和肝细胞的炎症状态。 , 每边 250 µm)。

肿瘤细胞侵入旁组织并直接接触的侵袭前沿被认为是了解肿瘤进展和转移所必需的实体瘤中最重要的区域。对这些区域的转录结构进行全面绘制有助于更好地了解分子病理学和个性化治疗策略的开发，例如实体瘤的免疫检查点阻断疗法。作为 TME 的一个基本生物学特征，由于研究工具的局限性，空间异质性在很大程度上被忽略了。在本研究中，基于使用立体序列的空间转录组学结构的综合映射，将侵袭前沿的空间异质性与 ICC 中的其他区域进行了比较，这有助于了解肿瘤行为，包括侵袭和转移。基于由 ST 载玻片边界线两侧的三层组成的构建模型，发现在离肿瘤最近的 250 µm 宽的层中观察到免疫细胞的富集和独特的免疫抑制微环境和肿瘤细胞的代谢重编程边界线的一侧。在免疫细胞中，巨噬细胞主要由聚集在侵袭前沿的主要 M2 样巨噬细胞组成，表明抗炎巨噬细胞对肿瘤进展的主要促进作用。此外，我们发现免疫检查点基因的表达增强，包括免疫细胞中的 CTLA4，我们还发现最靠近边界层的肿瘤细胞中的免疫逃避特征上调。因此，在侵袭前沿发现了更具抑制性的免疫微环境，这可以促进实体瘤的进一步肿瘤侵袭和转移。

基于边缘区域的精确分割，我们的研究还全面表征了肿瘤细胞在侵袭前沿的不同细胞状态。通过分析与肿瘤细胞行为相关的常规途径，我们观察到更多来自脂肪酸代谢上调的能量供应成分，包括与肿瘤外层相比，肿瘤侧最接近层的肿瘤细胞中脂肪酸合成和氧化增加 -副肿瘤边界，进一步表明这些位置的肿瘤细胞经历了增强脂肪酸代谢的明显代谢重编程，以增加能量供应，以更好地促进肿瘤细胞侵袭。同时，我们还发现，与外部区域相比，离边界线旁瘤侧最近的层的细胞成分的缺氧状态、糖酵解水平以及增殖能力和凋亡水平均有所增强。由于所有这些结果都揭示了侵袭前沿周围区域的不同炎症状态和特殊代谢特征，我们将以肿瘤边界为中心的 500 µm 宽区域重新定义为“侵袭前沿”，这比之前定义的 1,000 µm 宽区域更合理以边界为中心。此外，为了增加能量供应，肿瘤细胞中增强的脂肪酸代谢的代谢重编程可以解释实体瘤的进一步肿瘤侵袭。因此，阻断这一过程的治疗方法可能是一种抑制肿瘤侵袭和转移的新疗法。

通过进一步表征侵袭前沿细胞成分的特征，我们发现侵袭前沿的肝细胞也发生了明显的炎症变化，SAA及其TFs高表达，包括ETV6、CEBPG、YY1和BHLHE40，反映了肝细胞的受损状况被肿瘤细胞侵入 45, 46。 SAA 可以直接协调先天免疫细胞的积累，如单核细胞、未成熟的 DC、中性粒细胞和 T 细胞。在侵袭前沿的巨噬细胞中检测到 SAA 受体，包括 FPR1 和 FPR2，并在靠近 Hep1 细胞处显着积累，这可能是由于受损的肝细胞分泌 SAA，在靠近边界处募集巨噬细胞所致。这种可能性与一项研究一致，该研究报告肝细胞上调 SAA1 表达并为小鼠模型中胰腺癌的肝转移提供了促转移生态位 45。 SAA 在侵袭前沿的高表达和富集可以解释该部位免疫细胞的聚集，这在其他研究以及我们自己的研究中都有报道。据报道，SAA 有助于 M2-巨噬细胞分化，这可以解释在侵袭性前沿发现更多 M2 样巨噬细胞的存在。此外，在其他实体瘤包括 HCC、结直肠癌肝转移和胰腺癌的侵袭前沿也证实了 SAA 的高表达和巨噬细胞的积累，并进一步发现与患者较差的预后相关。我们的工作确定了轴向侵入前沿的异质性，肿瘤细胞状态的高度变化和沿边界的受损肝细胞分布。最重要的是，我们发现了SAA在侵袭前沿对肝细胞表达的新作用，它反映了肝细胞的受损状态，并介导巨噬细胞（主要是M2样巨噬细胞）的募集以进一步促进肿瘤进展.

尽管 Stero-seq 提供了高纳米级分辨率（220 nm × 220 nm/点）来捕获每个细胞几百个点的转录物，但仍然难以识别细胞边界并在单个细胞水平上捕获准确的转录物。 在我们的研究中，纳米级分辨率的原始空间表达矩阵被转换为 25 µm 平方大小（50 × 50 bins/pseudo-spot）的细胞大小的伪点，并以最高概率分配给特定的细胞类型。 因此，由于技术限制，仍然难以在空间上绘制解析的单细胞遗传信息并精确推断细胞类型

总之，本研究表征了肿瘤生态系统的复杂性和异质性，以及 ICC 不同区域位点的细胞相互作用，确定了免疫细胞浸润、抑制性免疫微环境、肿瘤细胞的代谢重编程以及在侵袭前沿富集的受损肝细胞。 . 我们还在 HCC、结直肠癌或胰腺癌的肝转移中验证了这一发现。 总体而言，该结果提供了对肿瘤侵袭前沿存在的异质性的全面理解和详细表征，这将有助于开发更精确和有效的治疗实体瘤的治疗靶点。

Method(我们来关注一下分析的方法)

聚类

空间注释

很有想法的文章，值得借鉴，尤其是空间细胞密度的分析和通路开关

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