10X Genomics单细胞转录组测序

一、单细胞及普通转录组比较

1. 单细胞转录组测序（scRNA-seq）在单个细胞水平上构建每个细胞的基因表达谱，反映细胞异质性，发现新的细胞类型，了解细胞表达调控机制。通过选取不同时间点的样本，再进行单细胞转录组测序，能够在单细胞水平获得基因“时间动态表达”的信息。单细胞侧重于在哪里表达及有无表达，传统测序侧重于表达高低。
2. 普通转录组测序是提取组织、器官、群细胞的混合RNA/bulk RNA进行测序，得到的是群细胞中单个基因的平均表达水平，用来比较不同组织间的表达差异，但对内部细胞异质性较强的系统很多异常基因表达的信息会出现丢失（以肿瘤为例，肿瘤中心细胞、肿块边缘的细胞、肿块周围的细胞，其转录组信息存在差异，传统手段将整个肿块或简单分区分割肿块，得到表达均值，而在某一类细胞中低表达的基因可能会被另一类细胞中相同基因的高表达水平所覆盖，造成结果差异）。

 

 

二、流程

 

1.   微珠DNA引物序列设计

     2.GEMs形成：微珠DNA引物序列与细胞/酶体系、油滴混合，形成油包水滴GEMs 

 

     3.构建文库：胞膜破裂释出mRNA 3’端poly(A)尾被凝珠poly(dT)捕获，逆转录形成cDNA文库，并经PCR大量扩增，加上测序接头进行测序

     4.数据分析：三维立体构建视图：  

三、数据分析：质控-降维-差异基因分析-富集分析-通路分析

1、质控：碱基质控，细胞及基因统计，细胞过滤 ；排除组织细胞分离损伤、无效逆转录或PCR等，导致细胞整体counts少、基因低表达、线粒体基因或者spike-in比例较高，对下游分析产生影响。Mapping报告：reads mapped to genome比对到基因组的reads占比应＞85%

 2、细胞降维聚类：PCA→t-SNE→UMAP 

           基因PC排名越低，则对数据差异的影响越小，PC1解释了数据最大的差异部分、标准差最大，PC2解释了数据第二大的差异部分；一个点代表一个细胞，聚集在一起的点代表有一定的相关性，距离越近相关程度越高。

 

 

 

 3、细胞类型定义 

 4、细胞簇基因表达：热图，气泡图，t-SNE /UMAP，小提琴图

 

 5、细胞簇基因功能富集分析：GO、KEGG、疾病富集及功能注解，PPI

 

 

 

 6、细胞簇状态演变：拟时序分析图，基因表达拟时序图，RNA速率分析，细胞分化预测

 

 7、配体-受体作用：细胞簇间配受体及样本差异互作图

 

 8、细胞周期分析：周期划分图，t-SNE图，比例图

 

9、转录因子调控分析

10、单细胞SNP、Indel、CNV分析

四、实验验证

资料来源

1、【陈巍学基因】视频56：10X分析单细胞表达_哔哩哔哩_bilibili

2、【陈巍学基因】单细胞RNA测序分析图解读_哔哩哔哩_bilibili