Microbiome：微生物在植物世代之间的旅程

最新推荐文章于 2023-07-23 15:16:14 发布

刘永鑫Adam

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分类专栏：扩增子科普

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微生物在植物世代之间的旅程

A microorganisms’ journey between plant generations

Microbiome

Impact Factor 10.465 | CiteScore 9.86

https://doi.org/10.1186/s40168-018-0459-7

发表日期：2018-04-26

第一作者：Nathan Vannier¹

通讯作者：Nathan Vannier¹

合作作者：Cendrine Mony, Anne-Kristel Bittebiere, Sophie Michon-Coudouel, Marine Biget & Philippe Vandenkoornhuyse

主要单位：

¹ 法国，雷恩大学（Université de Rennes 1, CNRS, UMR 6553 EcoBio, campus Beaulieu, Avenue du Général Leclerc, 35042, Rennes Cedex, Franc）

摘要

背景

植物被多种多样的微生物所定植，这些微生物形成了一个菌群，并为它们的宿主执行额外的功能。因此，这种微生物群可以被认为是一个工具箱，使植物能够缓冲性地适应当地环境变化，并对植物的适应性产生积极的影响。在这种情况下，微生物群向后代的传播代表了一种确保在栖息地内存且在有益共生的方式。这类传播的例子主要描述了种子传播和一些致病微生物。我们研究了在无性系植物网络中，共生伙伴向植物后代的传播。

方法

我们以无性繁殖的植物金钱薄荷/斑叶连钱草(Glechoma hederacea)为植物模型，在控制微生物存在的同时，将新产生的无性繁殖后代置于分离的花盆中生根。我们使用16S和18S rRNA基因的扩增子测序方法分别针对细菌/古生菌和真菌来描述母本和克隆植物后代的根系菌群。

结果

我们证明了相当比例的母本植株共生细菌和真菌径直传递给子代植株，有趣的是，古生菌并没有传播给子代植物。传播的群落具有较低的丰富度，这表明在传播过程中发生了过滤。我们发现在子代之间，微生物的传播库是相似的，构成了一个特定的微生物群的遗传可能性，开启了对植物全基因组的新理解。我们还发现，与母株之间的距离和生长时间对微生物群落传播的丰富度有显著影响。

结论

在该无性系植物中，微生物通过连接在个体间传播，从而保证了新生植株的微生物伙伴的可用性以及微生物在宿主间的分散。这个先前未被描述的生态过程允许微生物在空间和跨植物世代传播。由于绝大多数植物是无性繁殖的，因此这一过程可能是生态系统功能的强大驱动因素，并在广泛的生态系统中促进植物和微生物群落的组装。

关键字克隆植物，微生物组，16S/18SrRNA，继代传播，微生物传播

日报

https://www.mr-gut.cn/papers/read/1072581111

菌群纵向传播维持植物共生功能体的延续

创作：小扣啊审核：周旸

2018年05月11日

植物通过将菌群传播给后代来确保有益共生体的存在；
以无性系植物欧活血丹作为模型研究母体和后代植株的根部菌群，发现多数母体植物的共生细菌和真菌垂直传播给后代，但不传播古菌；
传播菌群的丰富度较低，说明存在菌株筛选过程；
传播菌群在子代植株间相似度高，组成了一个特定的可遗传微生物群，有助于理解植物共生功能体；
距离母株的距离和生长时间显著影响传播菌群的丰富度；
菌群传播极大地推动了植物-菌群共生体的建立和运作。

主编推荐语(周旸): 共生菌群的纵向传播现象也存在于植物中。通过研究共生菌群在无性系植物亲代-子代之间的传递，本研究发现传播菌群具有特定的结构，并且受到环境、生长时间的影响。本研究对于了解植物-菌群互作、植物共生功能体的维持具有重要参考价值，值得专业人士关注。

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背景

所有活着地植物都经历过与内生微生物的相互作用，已知它们都有丰富多样的共生体(即长期的相互作用达到稳定的平衡)。包括真菌、细菌和古菌，它们共同构成了植物的微生物群。利用玉米品种进行的研究表明，由寄主植物对微生物根际组成的遗传控制是有限的，但也是可以检测到的。因此，植物微生物群的组成，至少在一定程度上，不仅是可在周围土壤中进行招募补充的微生物库的结果，而且也是在植物内层进行植物选择性招募补充的结果。这个过滤系统包括植物防御和植物-微生物信号机制，以及通过对不太有益真菌的营养禁运来促进最佳合作者。

从理论上看，垂直和伪垂直传输（同源共生体从亲本遗传给共享一致环境的子代）是有利的，因为它们限制了寻找合适共生体的成本。垂直传输将因此允许在植物和它的共生体之间的“连续性的伙伴关系”。在这一背景下，微生物群的遗传力也是植物保证其后代环境质量的一种途径。在自然环境中，植物可以通过制种或克隆繁殖进行繁殖。一些研究证明了内生共生菌通过种子克隆寄主植物上进行垂直遗传：最著名的例子可能是胁迫保护内生菌Neotyphodium coenocephalum在几种草本植物中传给后代。

最近的发现表明，形成无性系植物网络的水平茎的营养伸长伴随着包括丛枝菌根真菌在内的一群微生物向空间上遥远的无性系后代的传播。微生物对植物后代的这种遗传力是不受环境（即，通过环境共享）或遗传行为调节的。这一过程将支持克隆植物后代的生态位构建，而微生物可以受益于选择性传播载体，使它们能够到达一个类似的、因此也是合适的宿主。克隆植物中的传播已被证明涉及物理克隆（即，生理集成）中的信息和资源共享。如Stuefer等人之前所提出通过共享克隆网络中的微生物，可能会出现一个额外的整合水平。

我们采用无性系草本种斑叶连钱草Glechoma hederacea作为模型。测试了通过克隆整合将微生物传递给克隆后代的假设，并提出了克隆植物中共享微生物群遗传力的新概念。这种植物的生长形态是由水平茎(即空中匍匐茎)连接的小枝网络构成的。这是最普遍的克隆形式之一。在无性系网络生长过程中，产生的子分枝可以通过干扰或分枝间物理连接的自然衰老从母株中分离出来，然后能够自行生长和有性繁殖。10个生态型的植物在受控条件下生长。首先，将无根的幼枝(母株)移栽到装有田间土壤的盆中。植物定向生长是通过强迫新排放的两个分枝的小分枝(子分枝)在装有灭菌基质的单独的花盆中生根(图1)。我们的目的是检测存在于母株根中的内生微生物，并通过无性系匍匐茎转移到子株。采用16S和18S rRNA基因的高通量扩增子测序进行检测和鉴定在根内胚层和匍匐茎节间的细菌、古生菌和真菌。我们通过分析实验中随机分布的对照点用以删除数据集中所有不能归因于植物介导的微生物转移的操作分类单元(OTUs)。

方法 Methods

生物材料 Biological material

我们使用无性系多年生草本植物金钱薄荷，这是研究无性系植物对环境约束反应的常用模型。金钱薄荷无性系体在斜向单轴匍匐茎上(即,在地面上连接)的节间每隔5至10厘米在节间产生新的直立的芽。每个无性系分株由两个叶节点、一个根系统和两个腋芽组成。在有控制条件的气候室中及缺乏富集基质的情况下，金钱薄荷不着急开花，只显示营养生长。在20℃下，在蛭石基质上生长3个月，昼夜循环12小时/12小时，以限制父本母本对其地理位置和栖息地的影响。营养繁殖是在无菌基质上进行的(50%砂，50%蛭石，120℃蒸压2次，蒸压1小时)。

实验条件 Experimental conditions

实验是在相同的无菌基质(50%的沙子，50%的蛭石)上进行的，条件也是白天12小时，夜晚12小时，温度20°C。每2天用去离子水浇灌植物以保证水分。每10天用低磷水溶液给植物浇水以提供必要的营养有利于菌根化。每次浇水时，每盆去离子水和肥料溶液的体积为25毫升。为了检测克隆网络中微生物的传播，我们将初始的无性系分株(ramet，母株)移栽到有田间土壤的花盆中，并使其定向生长以迫使新抽出的分株在不同的含有灭菌基质的花盆中生根(图 1)。我们共使用了与上述10个生态型相对应的10个克隆片段。每一个母株产生由5个无性系分株(1株母株和4株子株)组成的克隆网络(例如，50个根样本)。在母株水平上分析菌群的组成，并与每个生态型的子株进行了比较。该设计基于10个重复，每个重复对应一个不同的生态型，能够考虑响应于测试土壤组成的克隆片段的自然变异性。

图1. 实验设计。a. 10个生态型的无性系小分枝在单独的花盆中生根，并被匍匐茎连接。在实验结束时，克隆网络由母株和四个子株组成。子分枝(第一和第二母株)沿着母株产生的两个主匍匐茎排列。带有母株的花盆填入均质化的田间土壤，带有子株的花盆填入灭菌的基质，而接触点仅由分隔两个连续的分枝的节间连接。M-母株，D1-一代子株 D2-2代子株。b. 实验设计图片：这些小盆只通过节间连接。

它确保所观察到的结果不是由于特定的生态型，而是作为金钱薄荷物种的一种普遍的模式。在实验过程中，为了限制分枝的扩展和限制植株的生长，将子分枝的第二个分枝去除，形成一个简单的网络，由5个分枝组成，其中母分枝和4个分枝平均分布在两个匍匐茎之间(每主匍匐茎2个)。利用两个匍匐茎，我们可以检验在无性系内潜在的传播是否是系统的，或者在匍匐茎之间传播是否有变化(即，母株中生物体的随机转移)。移植的克隆单位(即，母系) 由一个成熟的分枝(叶和腋芽)和一个连接的匍匐茎节间组成(提供资源以支援无性系分株的生存)且无根(避免微生物先在根部定植)。在一个经常被修剪的生长着金钱薄荷种群的中生代草原上，靠近树篱的接口处收集土壤。土壤是典型的以片岩为土壤母质的形成层。地上植物区系组成为5 ~ 10个不同的植物种类，L. perenne 和 T. repens被认为是最丰富的一种。然后通过0.5厘米的滤网过滤土壤，去除石头和树根。当无性系达到一个母株和四个有根的子株的阶段时，实验停止，收获无性系。通过将母株和子株的无性系网络分为匍匐茎节间、根和芽来分析根和节间样品中内层微生物的组成。每个节间和根样首先用水仔细清洗，然后用1% Triton×100 (Sigma)溶液清洗（三遍）最后是无菌水(5次)。这个过程确保了非内层微生物的去除。为了控制潜在的污染，三个对照罐被随机分配到实验设计中。这些花盆都是用同样的无菌底物，并且和其他花盆的浇水方式相似。在实验结束时从这些对照罐中取样，以便从序列分析和所有后续统计分析中去除所有非植物传播的污染微生物。在DNA提取和后续的分子工作进行之前，所有根、节间和底物样品均在- 20℃冷冻。

DNA提取与扩增 DNA extraction and amplification

DNA提取自干净的根和节间（internodes），以及来自对照花盆的基质，使用的是DNeasy 植物迷你试剂盒(Qiagen)。18S rRNA基因通过利用真菌引物NS22b (5′-AATTAAG CAGACAAATCACT-3′) and SSU817 (5′-TTAGCATGG AATAATRRAATAGGA-3′)进行扩增。PCR的扩增条件为95℃初始变性4分钟，35个循环，95°C 30秒，54°C 30秒，72℃持续1分钟，最后一次延长时间为72°C持续7分钟。利用细菌引物799F(5’-AACMGGATTAGATACCCK G-3 ') 和1223R (5 ’ -CCATTGTAGTACGTGTGTA-3 ')扩增16S rRNA基因。PCR的扩增条件为94℃初始变性4分钟，32个循环，94°C 30秒，54°C 30秒，72℃持续1分钟，最后一次延长时间为72°C持续10分钟。16S rRNA基因也通过巢式PCR扩增得到。第一个PCR引物是e Wo_17F (5′-ATTCY GGTTGATCCYGSCGRG-3′) and Ar_958R (5′-YC CGGCGTTGAMTCCAATT-3′) PCR的扩增条件为94℃初始变性2分钟，35个循环，94°C 30秒，57.5°C 50秒，72℃持续50s，最后一次延长时间为72°C持续10分钟。第二个PCR引物为Ar_109F (5′-A CKGCTCAGTAACACGT-3′) and Ar_915R (5′-GT GCTCCCCCGCCAATTCCT-3′) PCR的扩增条件为94℃初始变性4分钟，32个循环，94°C 30秒，57°C 30秒，72℃持续1min，最后一次延长时间为72°C持续10分钟。所有的扩增反应都是用Illumina公司RTG PCR beads (通用电气医疗集团)和目标2μL提取出的DNA，且PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行可视化检测。

测序和数据整理 Sequencing and data trimming

所有PCR扩增产物均使用Agencourt AMPure XP试剂盒进行纯化。纯化后对扩增产物进行定量分析，并使用高灵敏度DNA芯片-生物分析仪(安捷伦)和Invitrogen荧光定量分析(Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒，ThermoFisher Scientific)对其质量进行检测。

然后使用为Illumina准备的NEBNextUltra II DNA文库试剂盒对所有PCR扩增产物进行末端修复和接头连接(新英格兰生物学实验室)。随着使用NEB next Ultra 2 multiplex oligo (双索引，新英格兰生物学实验室)的一个PCR步骤进行样本混合建库。然后对混样文库进行定量，采用安捷伦高灵敏度DNA芯片的生物分析仪进行质量检测，以及使用SmartChip martchip RT PCR (Takara-Wafergen)进行定量PCR。扩增子样本按等摩尔浓度混合，采用LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche)进行定量PCR，产物在人类和环境基因组的Rennes平台的Illumina MiSeq仪器上(法国)进行双端测序(2×250)。数据整理由不同的步骤组成：引物去除(Cutadapt) 和抑制含有不明碱基的序列。另外一个步骤是使用自制的脚本检查序列方向。这种严格的数据调整产生了9,592,312个读长。裁剪好的序列使用FROGS 流程进行分析。(bio-informatic workbench “X. SIGENAE” [http://www.sigenae.org/])。用自定义程序对古菌和真菌进行FROGS预处理，用FROGS标准程序对细菌读长进行FROGS预处理。在这个预处理过程中，利用Flash对细菌读长进行组装。聚类步骤使用SWARM从而避免使用识别阈值对OTUs中的序列进行分组。按照流程设计者的建议，采用最大聚合距离为1，然后是第二步，最大聚合距离为3执行降噪步骤。使用FROGS嵌合体去除工具过滤嵌合体。为了避免人造OTU的影响，我们还使用了一个过滤器来保留至少三个样本中存在序列的OTU。所有的统计分析也做了一个五样本过滤器但结果相似。我们在此基于归属统计的结果仅提出R2真菌和R1古生菌这表明更好的归属质量。使用Silva 123 16S数据库来确定细菌和古生菌OTUs的归属分类注释，使用Silva 123 18S数据进行真菌OTUs的归属分类注释。然后根据隶属关系的质量以阈值至少为95%的覆盖率和95%的BLAST一致率对OTUs进行过滤。在FROGS中使用严格参数使我们最终获得了4068,634个细菌读长、2,222,950个真菌读长和113,008个古细菌读长。使用R(版本3.3.0)采用vegan包中的“rarefaction”功能生成稀疏曲线。我们制作了根、匍匐茎以及对照盆栽样品的细菌、真菌和古菌群落的平均稀疏曲线，以确定测序深度是否足以描述操作分类单元(OTUs)的预期数量。测序深度足够详细描述微生物群落(附图1)。按样本读长的数量均质化，以便后续的统计分析。根据使用相同的R包对稀疏曲线的图形观察，将样本归一化到相同的读长数量，在此步骤中，从数据集中删除读长数少于标准化值的样本。有在对照花盆土壤中发现的OTU都被从数据集中移除。三个对照罐包含0个古细菌读长。3个对照罐中有2个含有0个真菌读长，我们发现最后一个对照罐中有19个OTU包含有3371个真菌读长。三个对照处理也包含65378、33773和37587个细菌读长且分别分布在153， 313和219 OTUs中。

序列数据可通过登录号PRJEB20603在欧洲核苷酸档案馆获得。真菌，细菌和古细菌处理后的数据集也可作为附加的材料是可用的。(附件文件2, 3 和 4)。

数据分析 Statistical analyses

将网络内各分株的位置和匍匐茎记录为两个因素进行统计分析。我们考虑了网络中的三个位置：母株，一代子株，二代子株。匍匐茎被视作一个因素两个水平：在生长过程中生长出的一代和二代匍匐茎。我们分析了G. hederacea生态型中的遗传力、丰富度和微生物装配的组成。我们分别分析了真菌和细菌的装配。我们未对古生菌数据进行统计分析，因为它们在母株根和匍匐茎节间中被发现但在子代根中未被发现。所有统计分析均使用R软件进行。

遗传力计算和零模型构建

Heritability calculation and null model construction

每个生态型的每个分类群的遗传力被测量作为呈现早母株中OTUs的数量，并由至少两个子株共享（我们还为第三子代第四子代测试了遗传力的计算）。为了确定所观察到的遗传力是否能被随机预测，我们将观察到的遗传力与一个零模型进行了比较。本程序旨在检验零假设，即来自母株的物种在每个子株中随机分布，并不反映来自母株的特定组物种的选择或传播。它允许评估观察到的遗传力指数大于零分布下的期望的概率。我们通过随机抽取母株池中微生物种类的样本来生成子株的微生物的群落，为10个生态型中的每一个建立了一个零模型。对于母株池中的所有物种来说，物种抽样的概率是相同的（即，与它们在母根中最初的丰富程度无关）。只有物种身份从一种模式改变到另一种模式而子代群落的物种丰富度保持不变。对于10个生态型内的每个子代植株群落，从母株池中随机抽取9999个虚拟群落，并计算每个模型的遗传力指数。当使用不太严格的遗传力时，结果是相似的（例如，OTU至少出现在一个子株中）但遗传力不能更严格，因为它会为大多数的零群落创建零继承OTUs的零群落，从而高估了观测值和随机遗传力值之间的差异。

对于每一个生态型, 我们计算了标准效果大小(SES), 根据Gotelli和McCabe的描述计算：SES =（Iobs−Inull）/ σnull其中Iobs为实测遗传力指标值，Inull是零分布的均值，σnull是其标准偏差。SES旨在量化各生态型遗传力指数相对于零分布的方向和大小。负的SES值表示比随机模型更低的遗传力（母株中不存在的微生物种类的遗传力），而正的SES值表示比随机期望更高的遗传力(母株微生物的遗传力)。选择性假设“greater”的单样本t检验

然后将应用于SES值，以确定在检查数据正态性之后它们是否显著大于零。

通过线性混合模型分析丰富度

Analyses of richness through linear mixed models

丰富度以样品中OTU的数量来计算。分别计算了细菌和真菌在整个群落和门级上的丰富度(各门OTU丰富度)。我们选择这两个尺度来检测微生物丰富度的一般模式，并检测这些模式在分类群之间的潜在变化。我们在门的尺度上进行分析，而不是在更精确的分类学水平上因为在较低的分类水平我们受到产生多隶属关系的序列隶属的约束。为了检测丰富度是否受克隆网络中样本位置的影响，我们使用R包" nlme “和” car “中的” lme “和” anova "功能执行线性混合效应模型。最初我们测试了母株和子株基因丰富度的差异。然后，我们通过考虑植物生态型中无性系(第一子代或第二子代)和匍匐茎(第一代匍匐茎、第二代匍匐茎)的位置作为解释变量，检验了第一和第二子代的丰富度差异。在混合模型中，通过考虑克隆(母株或子株)的位置及将匍匐茎作为固定因子，将植物生态型为随机因子，从而控制生态型诱导的方差和统计依赖性。用残差的图形表示来验证模型残差的正态性并且必要时对数据进行对数或平方根转换。对于一些在样本中表现出低丰度的真菌和细菌群体，测试丰富性差异的模型并不能保证残差的正态性，因此这些结果没有被提出。

微生物群落组成分析

Analyses of microorganisms community composition

采用PLS-DA(偏最小二乘法判别分析)方法，检测母株与子株之间、子株与子株之间的菌群组成是否存在显著差异。PLS- DA由偏最小二乘回归分析(PLS)组成，其中响应变量是分类的(y-block;描述生态型中的位置)，表示统计单元的类成员。这个程序使得确定是否x-blocks的方差可以被y-blocks显著地解释成为可能。x-blocks(OTUs丰度)在PLS-DA分析中使用自尺度算法(即，中心列为零均值，刻度为单位方差)。进行预处理。PLS-DA过程包括产生p值的交叉验证步骤，p值表示PLS-DA方法关于数据集的有效性。PLS-DA程序也表达了统计敏感性表明模型效率的形式为误分类样本在类别模型所接受的类别中所占的百分比。我们使用这个模型的目的是测试群落组成的方差，这个方差可以用分枝在克隆中的位置来解释。根据所测试的组，整个数据集被细分为两个或三个组(例如，母株vs一代子株vs二代子株，母株vs所有子株，一代子株vs二代子株)。

结果

古菌、细菌和真菌群落在Glechoma hederacea根中的分布

Archaeal, bacterial, and fungal communities in the roots of Glechoma hederacea

在母株中发现了古菌(只有太古菌门Thaumarcheota )、真菌和细菌。子株中未检出古菌，子株根中检出真菌和细菌(Fig. 2)。通过比较从母株和子株的根中获得的序列，发现在母株和子株中有100%相同的读长的子集，分别占子株真菌和细菌的读长34和15%。遗传力计算为在母株和至少两个子株的根中发现的OTUs的数量，对于细菌从15到374个OTUs (μ= 100.2±118.6)即对于真菌为从0到12 OTUs (μ= 6.1±3.63),这取决于生态型。检验所观察到的遗传力是否高于随机预测(即随机分布OTUs)，我们使用了一种零模型方法，即在保持OTU丰富度不变的情况下，对实验样本中的真菌或细菌物种进行随机识别。因此，对于每个生态型，我们通过从所有母株根群落(区域池)中取样物种，随机产生细菌和真菌子群落并将我们数据集中观察到的遗传力值与随机遗传力值的分布进行比较。零模型方法表明，所观察到的群落中母株和子株根中的OTUs遗传率显著高于随机预测的结果。(具有备择假设“更高”的单样本t检验，P < 0.01 t = 3.03, df = 8, P < 0.001 t = 6.11, df =9分别为真菌和细菌) (附图2)。除了发现在子代根中非随机的OTUs的存在，我们还在网络中连接着的分枝匍匐茎节间发现了真菌和细菌群落(附图3)。这些节间表现出与子代根中相似的丰富度的门，细菌和真菌在G. hederacea无性系网络中的传播得到了清楚的证明。

传播过程中微生物群落的过滤

Microbial communities filtration during transmission

内生微生物在传播过程中经历了强烈的过滤。子代根的真菌OTUs丰富度明显低于母株根，母株群落平均有40个OTUs，而子株群落平均只有10个OTUs（线性混合模型，F1,31 = 280, P < 0.001;母亲无性系分株40±7;子株无性系分株 10±3) (图2)。同样显著的模式在细菌中也被观察到，母株菌群平均有800个OTUs，而子株菌群平均有100个OTUs（线性混合模型，F1,39 = 410, P < 0.001;母亲无性系分株800±131;子株无性系分株 100±100，图2)。观察到传播菌群的“低”丰富度表明，传播菌群是从原始菌池(即，母株微生物群)中过滤出来的。生态型对传播菌群的丰富度也有显著影响(有关使用的统计数据和随机因素的详细信息，请参阅“方法”一节)。通过对母株和子株根中微生物的比较，发现在菌群传播过程中，大多数门水平的丰度普遍下降。定殖于根中的真菌群落绝大多数来自子囊门(106 OTUs)和担子菌属(39 OTUs)，小部分来自肾小球菌门(24 OTUs，最近被认为是一个Glomeromycotina亚门)、接合菌群(7 OTUs)和壶菌群(4 OTUs) (图2a)。子株根中的子囊门和肾小球菌门的平均OTU丰富度比母株根中的低, 而担子菌门的OTU丰富度变化不明显。这一引人注目的观察结果清楚地表明存在一种依赖真菌的过滤机制。定植于根上细菌群落主要分布在3384个OTUs上，其中大部分属于变形菌门(2009 OTUs)和拟杆菌门(715个OTUs)约占所有序列的80%，其余20%属于6个附加门(Fig. 2b)。与真菌一致，在变形杆菌、拟杆菌、酸杆菌门、放线菌和厚壁菌门等门水平，子株根部的细菌OTU丰富度明显低于母株根部。这一观察结果表明，滤过机制对细菌门的影响是不显著的。

图2. 在无性系网络的不同位置，根内胚层细菌和真菌群落的组成.
a. 在无性系网络中不同位置的根样品中发现的每个真菌门的平均OTUs数和所有门的平均总OTUs数(母株，第一子株，或第二子株)。竖条表示每个门的平均标准误差。通过线性混合模型检测克隆网络中母株和子株OTUs丰富度的差异是显著的 P < 0.001。
b. 在无性系网络中不同位置的根样品中发现每个细菌门的平均OTUs数量和所有门的平均总OTUs数(母株，第一代子株或第二代子株)。竖条表示每个门的平均标准误差。在无性系网络中，用线性混合模型检测母株与子株间OTU丰富度差异有显著性 P < 0.001

特定微生物群的遗传力

The heritability of a specific cohort of microorganisms

采用多元回归和偏最小二乘判别分析方法(PLS-DA)，来评估母株和子代根系中微生物群落组成的差异(见上面材料和方法，附加文件1)。这种分析的优点是它能够测试基于数据集中样本的分组因素的假设(即，一个解释因素)并获得该因子的显著性以及该因子解释的方差部分。有了这个分析，整个数据集就可以被使用，相比NMDS方法，大部分的方差是守恒的。

该方法中样本之间的距离如Bray-Curtis或Jaccard总结了样本之间的方差。不论是真菌(PPLS-DA = 0.001, PMothers vs Daughters < 0.01, explained variance = 87.3%, 图3a)，还是细菌 (PPLS-DA = 0.001, PMothers vs Daughters < 0.01, 解释率 = 72.4%, 图3b)，相较于母株，子代群落组成有显著的差异。这些母株和子株之间微生物群落组成的差异可以通过在传播过程中观察到的丰富度的减少来解释。这些结果表明，原来的微生物池只有一部分是由母株传给子株的(即，一组特定的生物体)。检验植物过滤对特定微生物群传播的假设，我们使用PLS-DA程序比较子代根内的微生物群落组成。根部群落的组成在第一和第二子代间无显著差异(PPLS-DA = 0.09真菌与 PPLS-DA = 0.33细菌，从而证实了一组特定的生物体同样地传播给了所有生态型的子代植株。

图3. 偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。
a. 用PLS-DA检测根细菌群落组成的位置(母株、一代子株和二代子株)的显著性。
b. 用PLS-DA检测根真菌群落组成的位置(母株、一代子株和二代子株)的显著性。
模型中作为分组因子的组用图表示。它们分别对应于母株、第一代子株和第二代子株。第一代和第二代分株独立于它们所属的匍匐茎被分组。本分析用于验证克隆网络中不同分枝位置的根具有相似的真菌和细菌群落组成的假设。各轴表示的方差百分比代表了分组因子所解释的群落组成差异。

扩散距离和扩散时间的影响

Effect of dispersal distance and dispersal time

我们发现沿着匍匐茎的细菌群落的丰富度稀释模式(线性混合模型，F1,18 = 6.13、P < 0.05)显示，与母株距离最远的子株细菌含量低于与母株距离较近的子株的细菌含量。这一发现表明细菌在子株中的定植受到传播距离的限制。这种丰富度稀释的模式也遵循了植物发育的过程，如在实验早期产生的匍匐茎更丰富(线性混合模型，F1,9 = 4.92, P < 0.05)，说明细菌群落丰富度也与扩散时间有关。另外，这些模式可能与克隆网络每个节点的累积过滤效应有关，从而减少了传播细菌的数量。相反，真菌群落没有检测到这些丰富度稀释模式，这表明，要么是传播物种的散布不受限制，要么是真菌群落在最初的传播过程中已经被强烈过滤。这两个非排他的假设得到了我们观察到的母株和子株之间真菌群落丰富度减少的变化的支持，这种变化可能依赖于不同真菌分类群的生活史和散布特征。

讨论 Discussion

这项工作首次展示了一种特殊的植物内层微生物群(真菌和细菌)的垂直传播和遗传能力。我们的工作与以前证明的微生物在植物间通过共同的菌丝网络传播的工作相呼应。然而，微生物通过菌丝网络的传播不同于无性系网络，因为无性系网络不是由植物组织构成的，因此微生物上存在着的环境过滤器(即，选择压力)是不一样的。在无性系植物中，植物的免疫系统应该对传播的微生物施加强大的选择压力。与其他研究一样，它支持将植物理解为一个复杂的实体，而不是一个独立的实体，并与必须将植物及其微生物群视为整体的观点一致。我们对微生物群传播的演示支持这样一种观点即微生物群及其宿主构成一个联合选择单元。这一发现与微生物群的遗传性这一观点并不冲突(微生物成分在2017年的《杜利特尔和布斯》中被隐喻为“歌手”)，在无性系植物中，实际上包括一组选定功能的遗传性(《杜利特尔与布斯》中的“歌”，2017)。因此，我们的工作突出了在整体实体中起作用的进化过程，并协调了整体和正在进行的斗争的进化方法。对于植物来说，沿着植物无性系网络传播的微生物群落延伸到微生物，这是之前证明的信息和资源的生理整合概念。这种集成的网络体系结构对宏共生功能体组织的思想提出了质疑，宏共生功能体组织中无性系分株可以作为微生物的汇点或来源。这样的结构可以保证共生功能体之间的交换，特别是在母源和子源之间“汇点”，从而增加了整个克隆体的适应性。事实上，一群已经通过植物过滤系统的微生物的遗传为新定植环境的招募提供了可利用的微生物库。这个微生物“工具箱”可以使植物迅速适应环境条件，从而在异质环境中提供适合的益处。这可能被同化为植物生态位建设，并在开拓新的栖息地时提供竞争优势。从微生物的角度来看，这些匍匐茎植物可以被视为生态廊道，在一定程度上促进了植物的扩散。环境中除了繁殖体传播，这个过程确保了传播的有机体从一个合适的寄主传播到另一个寄主。因此，当在新环境中定植生根时，传播的共生伙伴可能受益于优先效应。因此，今后的工作需要加以解决

(i)克隆网络中微生物传播的方向(单向和双向)以及

(ii)传播机制的模式(主动或被动)，以及

(iii)在传播过程中过滤以确定

(iv)该过程在生态系统中的重要性的微生物。

关于最后一个方面，植物群落以无性系植物为主，我们的研究结果证明了无性系植物在营养级间微生物传播中的基本作用，揭示了植物克隆的一种新的生态功能。考虑到本文所展示的遗传力过程影响了生态系统中的不同部位，由微生物群的过滤和无性系植物的转移组成的这一新的生态系统过程是至关重要的。

结论

本研究的结果证实了克隆植物Glechoma hederacea 的一部分微生物组传递到其无性系后代。我们证明只有少数特定的微生物被传播，表明在传输过程中存在滤波过程。这些发现证实了在无性系世代之间特定微生物群的传播，并影响了我们对植物共生功能体的理解。
在克隆植物中，连接在一个共同的网络中不同的共生功能体，微生物可以相互交换，构成克隆生物的共生功能体的另一个层次的组织。

写在后面

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