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基于16S rRNA测序和RT-qPCR的硫化矿物表面微生物群落组成分析
Analysis of Microbial Community Composition on Sulfide Mineral Surface Based on 16S rRNA Sequencing and RT-qPCR
黄珊珊1，马丽媛2, 3, *，刘学端1, 3
1资源加工与生物工程学院，中南大学，长沙，湖南；2环境学院，中国地质大学（武汉），武汉，湖北；3生物冶金教育部重点实验室，中南大学，长沙，湖南
*通讯作者邮箱: maly@cug.edu.cn
摘要: 金属硫化物矿山具有pH值低、重金属含量高等特点，为通过氧化亚铁和无机硫获取能量的冶金微生物提供了独特的寡营养生态位，其中嗜酸硫杆菌属（Acidithiobacillus）内不同种具有不同的铁硫氧化功能，是酸性矿山环境及冶金过程的代表性优势属。16S rRNA扩增子测序是研究微生物群落组成及多样性的重要手段，但无法根据测序结果对Acidithiobacillus在种水平上加以区分。实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）因特异性好，灵敏度高，已成为现今物种定量分析的主流技术之一。为准确刻画浸矿过程中硫化矿物表面具有不同铁硫氧化功能的冶金微生物群落组成规律，本文将16S rRNA测序与RT-qPCR技术相结合，提出了一种高效精确的冶金微生物群落结构分析方法，能够在种水平区分高丰度的铁硫氧化功能类群，对研究微生物群落氧化硫化矿物的过程机理以及指导工业菌群的优化调控具有重要意义。
关键词: 酸性矿山，矿物表面，微生物，16S rRNA测序，RT-qPCR
材料与试剂
1.50 ml离心管（Corning，catalog number: 352070）
2.10 ml离心管（CNWTC，catalog number: TYA04）
3.5 ml离心管（Eppendorf，catalog number: 0030119401）
4.1.5 ml尖底离心管（Fisher Scientific，catalog number: 05-408-129）
5.各种型号枪头（20 µl，200 µl，1 ml）
6.0.2 mm玻璃珠
7.2×SYBR Green qPCR Master Mix核酸染料
8.96孔PCR板（Axygen，PCR-96-FLT-C）
9.(NH4)2SO4
10.K2HPO4
11.KCl
12.Ca(NO3)2
13.MgSO4·7H2O
14.乙醇（96%-100%）
15.琼脂糖
16.TBE缓冲液（0.5x）
17.双链DNA高灵敏度荧光定量试剂盒（Invitrogen，catalog number: Q32851）
18.TIANamp® Bacteria DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech，catalog number: DP302），含有以下组分：
1)吸附柱CB3
2)收集管（2 ml）
3)缓冲液GA
4)缓冲液GB
5)缓冲液GD
6)缓冲液PW
7)缓冲液TE
8)蛋白酶K
19.溶菌酶缓冲液（20 mM Tris，pH 8.0；2 mM Na2EDTA；1.2% Triton；终浓度为20 mg/ml的溶菌酶）
20.9K培养基（见溶液配方）
21.琼脂糖凝胶（见溶液配方）
仪器设备
1.烧杯
2.移液枪
3.分析天平
4.高速离心机
5.光学显微镜
6.涡旋混合器
7.电泳仪
8.NanoDrop-1000微量分光光度计
9.Qubit 2.0核酸蛋白定量仪
10.Illumina Miseq测序平台
11.Veriti 96-well Fast Thermal Cycler梯度PCR仪 （Thermo Fisher，model: 4375786）
12.Bio-rad iCycler iQ实时定量PCR监测系统
实验步骤
1.矿物表面微生物收集
1.1充分振荡混匀含有微生物的固液混合样品，吸取5 ml置于10 ml离心管中，2,000 × g离心2 min。
1.2离心后弃上清，或转至另一新的10 ml离心管中，以收集浸出液中的游离微生物。
1.3利用25 ml新鲜9K培养基，将离心管底部矿物样品重悬至50 ml离心管中。
1.4向管中加入1 g直径0.2 mm玻璃珠，然后在涡旋混合器上振荡5 min。
1.5将上清液转移至收集管中，并在光学显微镜下检查是否有微生物细胞。
1.6重复上述矿物样品重悬步骤，直至上清液中未观察到细胞存在，则吸附在矿物表面微生物已被完全洗脱下来。
1.7分别将含有游离微生物和吸附微生物的上清液在12,000 × g转速下离心10 min，弃上清。
1.8加入1 ml新鲜9K培养基，重新悬浮菌体，将其转入新的1.5 ml尖底离心管
中，12,000 × g离心2 min，弃上清。
1.9重复步骤1.8 3-5次，以去除浸出液中残留的重金属离子和微细粒矿渣，避免对DNA提取造成影响。
1.10立即采用试剂盒对微生物菌体细胞进行DNA提取。
注：应尽量去除体系中的重金属离子和微细粒矿渣，防止提取的DNA片段较
小或质量下降。
2.DNA提取
使用TIANamp® Bacteria DNA提取试剂盒进行DNA的提取，具体步骤如下：
2.1向步骤1.9所得的菌体中加入100 μl缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮；加入100 μl溶菌酶缓冲液，37 °C温育30 min；加入20 μl蛋白酶K，吸打混匀；加入220 μl缓冲液GB，振荡约15 s后，70 °C放置10 min以上。
注：若缓冲液GA或GB中有沉淀，可在37 °C水浴至溶解，摇匀后使用。
2.2 加入220 μl乙醇（96-100%），充分震荡约15 s后，加入吸附柱CB3中（吸 附柱放入2 ml收集管中），13,400 × g离心30 s，丢弃废液。
2.3 向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD（使用前确保已加入96-100%乙醇）， 13,400 × g离心30 s，丢弃废液。加入600 μl缓冲液PW（使用前确保已加 入96-100%乙醇），13,400 × g离心30 s，丢弃废液。重复加入缓冲液PW 并离心弃废液。
2.4 采用13,400 × g离心2 min，将吸附柱CB3放置于一个干净的1.5 ml离心 管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加80 μl洗脱缓冲液TE。室温放置2-5 mi n，13,400 × g离心2 min，此时上清液中即含有基因组DNA。
注：DNA提取完成后置于-20 °C保存，应尽量避免反复冻融，以防止降解。
3.群落组成分析
3.1高通量测序
1）使用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）扩增DNA样本的16S rRNA基因V4区，PCR反应条件为：94 °C预变性5 min后，进行28个循环（94 °C变性45 s，62 °C退火45 s，72 °C延伸1 min），最后在72 °C下延伸10 min。PCR产物经纯化后用于文库构建，经质量检测合格后采用PE300测序策略于 Illumina Miseq测序平台进行高通量测序（详见Ma 等, 2018）。
3.2RT-qPCR
1）标准曲线的构建
a.采用特异性引物（表1）对Acidithiobacillus属内四个优势种的基因组进行普通PCR扩增，普通PCR反应程序为：94 °C预变性3 min；[94 °C解链30 s，特异退火温度（55 °C-59 °C）30 s，72 °C延伸1 min]（30个循环）；72 °C延伸5 min。测定PCR产物浓度并换算成拷贝数，作为标准品经10倍梯度稀释后，取109-102 copies/μl稀释样品，以构建不同种菌株的标准曲线。
b.拷贝数换算公式：拷贝数（copies/μl）= 
注：其中c（ng/μL）为浓度；MW=碱基数目（bp）× 660（Daltons/bp）
表1. RT-qPCR扩增 Acidithiobacillus菌属的特异性引物信息*
Target species | Primer name | Primer sequences (5’-3’) | Amplicon length (bp) |
Acidithiobacillus ferrooxidans | rus-S rus-A | ACAAGGGATTCGGTCATAGTTT CCGTCGGATGCCAGGTAAA | 153 |
Acidithiobacillus caldus | soxX1-S soxX1-A | CAGTATTCCACCCATCAACG ACTCCACCTGGCAAGACAT | 114 |
Acidithiobacillus thiooxidans | Sqr-S Sqr-A | GCTCGGCAGCCTCAATAC GGTCGGACGGTGGTTACTG | 136 |
Acidithiobacillus ferrivorans | CspA-S CspA-A | TCCTCAGCCTGCATGCCT TGGTACAGTAAAGTGGTTCA | 180 |
* Ma 等, 2017a; Ma 等, 2017b; Ma 等, 2018; Tao 等, 2018; Wang 等, 2020
2）RT-qPCR反应
a.基于Bio-rad iCycler iQ实时定量PCR监测系统，采用四个优势种的特异性引物进行RT-qPCR扩增。反应体系（25 µl）包括：2×SYBR Green核酸染料，12.5 µl；上下游引物，各0.5 µl；双蒸水，6.5 µl；cDNA模板，5 µl。反应条件为：95 °C，5 min；40个循环内（95 °C，30 s；55-59 °C，30 s；72 °C，30 s）；95 °C，1 min；55 °C，10 s（其中55-59 °C为不同引物的特异退火温度）；80个循环内（自59 °C每个循环增加0.5 °C，至99 °C，每个循环10 s）；4 °C延伸，反应终止。每个样品设置三个技术重复，同时每板设置三个阴性对照。
结果与分析
1.通过1.0%（w/v）琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop-1000微量分光光度计检测矿物表面微生物DNA提取质量，并利用双链DNA高灵敏度荧光定量试剂盒在Qubit 2.0核酸蛋白定量仪上测定DNA浓度。
2.16S rRNA基因测序技术为微生物群落的组成及多样性研究提供了强有力的工具，能够识别已知和未知物种，但通常只能鉴定至属水平（Lukhele 等, 2019）。据报道，酸性矿山环境物种多样性相对较低，代表性优势类群约占微生物总量的90%，如既能氧化亚铁又能氧化硫的嗜酸硫杆菌属（Acidithiobacillus）和硫化杆菌属（Sulfobacillus），仅能氧化亚铁的钩端螺旋菌属（Leptospirillum）和铁质菌属（Ferroplasma）。其中，Acidithiobacillus是广泛存在于AMD环境的典型类群，该属中嗜酸氧化亚铁硫杆菌（A. ferrooxidans）和耐冷嗜酸硫杆菌（A. ferrivorans）能够氧化亚铁和硫获取能量，而嗜酸氧化硫硫杆菌（A. thiooxidans）和嗜酸性喜温硫杆菌（A. caldus）仅能够通过氧化矿物中的硫获得能量维持自身代谢（Chen 等, 2015; Méndez-Garcíaet 等, 2015）。RT-qPCR虽无法挖掘未知物种信息，但能够对已知物种进行精确定量。
表2. 铁硫富集群落在黄铜矿浸出过程中优势属相对丰度
Genus | Fe-O | S-O | ||||
Day 12 | Day 18 | Day 24 | Day 12 | Day 18 | Day 24 | |
Acidithiobacillus | 99.48% | 96.01% | 64.91% | 81.76% | 82.73% | 76.36% |
Leptospirillum | 0.02% | 0.23% | 23.85% | 0.004% | 0.36% | 16.48% |
Sulfobacillus | 0.06% | 3.39% | 8.43% | 18.04% | 16.77% | 11.31% |
Sphingomonas | 0.05% | 0.04% | 0.00% | 0.02% | 0.003% | 0.00% |
Streptophyta | 0.03% | 0.005% | 0.01% | 0.02% | 0.01% | 0.01% |
3.在分别利用富铁少硫能源底物和富硫少铁能源底物驯化菌群（分别命名为Fe-O和S-O）进行黄铜矿浸出实验中，16S rRNA高通量测序结果表明，在各组中Acidithiobacillus均为绝对优势属（＞60%），在Fe-O群落浸出初期占比甚至高达99%（表2），但铁氧化菌或硫氧化菌在群落中的占比并不清楚。基于RT-qPCR精确定量结果，获得A. ferrooxidans、A. ferrivorans、A. thiooxidans和A. caldus的扩增比例，带入16S rRNA测序结果中Acidithiobacillus的相对丰度，计算属内四个优势种在整个样本中的相对量，并将微生物群落组成以柱形图展示。如图1所示，Acidithiobacillus属内不同铁硫氧化功能类群的相对丰度得以明确，在铁富集浸出体系中，A. ferrooxidans和A. caldus为优势种，分别占30%-45%和30%-65%；而A. thiooxidans和A. ferrooxidans在硫富集浸出体系中占据主导地位，相对丰度分别约为50%和20%。因此，在16S rRNA测序的基础上，联合RT-qPCR技术精确定量Acidithiobacillus属的不同功能类群，能够更加全面揭示浸出过程中群落组成及演替规律，为冶金微生物的浸出行为及机理研究奠定基础。（Ma 等, 2018; Tao 等, 2018）。
图1. 铁硫富集群落在黄铜矿浸出过程中群落演替规律
溶液配方
1.9K培养基
(NH4)2SO4 | 3 g |
K2HPO4 | 0.5 g |
KCl | 0.1 g |
Ca(NO3)2 | 0.01 g |
MgSO4·7H2O | 0.5 g |
溶于1 L蒸馏水中 |
2.琼脂糖凝胶（1%）
琼脂糖 1 g
TBE缓冲液（0.5x） 100 ml
致谢
本工作的顺利开展得益于国家自然科学基金项目（资助号：31570113和42007306）和中南大学生物冶金教育部重点实验室基金（资助号：MOEKLB1702）的支持。
参考文献
1.Chen, L. X., Hu, M., Huang, L. N., Hua, Z. S., Kuang, J. L., Li, S. J. and Shu, W. S. (2015). Comparative metagenomic and metatranscriptomic analyses of microbial communities in acid mine drainage. ISME J 9(7): 1579-1592.
2.Lukhele, T., Selvarajan, R., Nyoni, H., Mamba, B. B. and Msagati, T. A. M. (2019). Diversity and functional profile of bacterial communities at Lancaster acid mine drainage dam, South Africa as revealed by 16S rRNA gene high-throughput sequencing analysis. Extremophiles 23(6): 719-734.
3.Ma, L., Wang, X., Feng, X., Liang, Y., Xiao, Y., Hao, X., Yin, H., Liu, H. and Liu, X. (2017a). Co-culture microorganisms with different initial proportions reveal the mechanism of chalcopyrite bioleaching coupling with microbial community succession. Bioresour Technol 223: 121-130.
4.Ma, L., Wang, X., Tao, J., Feng, X., Zou, K., Xiao, Y., Liang, Y., Yin, H. and Liu, X. (2017b). Bioleaching of the mixed oxide-sulfide copper ore by artificial indigenous and exogenous microbial community. Hydrometallurgy 169: 41-46.
5.Ma, L., Wang, X., Liu, X., Wang, S. and Wang, H. (2018). Intensified bioleaching of chalcopyrite by communities with enriched ferrous or sulfur oxidizers. Bioresour Technol 268: 415-423.
6.Méndez-García, C., Peláez, A. I., Mesa, V., Sánchez, J., Golyshina, O. V. and Ferrer, M. (2015). Microbial diversity and metabolic networks in acid mine drainage habitats. Front Microbiol 6: 475.
7.Tao, J., Qin, C., Feng, X., Ma, L., Liu, X., Yin, H., Liang, Y., Liu, H., Huang, C., Zhang, Z., Xiao, N. and Meng, D. (2018). Traits of exogenous species and indigenous community contribute to the species colonization and community succession. Front Microbiol 9: 3087.
8.Wang, X., Ma, L., Wu, J., Xiao, Y., Tao, J. and Liu, X. (2020). Effective bioleaching of low-grade copper ores: Insights from microbial cross experiments. Bioresour Technol 308: 123273.
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