基于宏基因组揭示根际细菌对甘草化感作用的响应及解毒作用
Metagenomics insights into responses of rhizobacteria and their alleviation role in licorice allelopathy
Article，2023-5-22，Microbiome，[IF 16.837]
DOI：https://doi.org/10.1186/s40168-023-01511-3
原文链接：https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-023-01511-3
第一作者：Yang Liu (刘洋)
共同第一作者：Hao Wang (王澔)
通讯作者：Shuo Jiao (焦硕)；Gehong Wei (韦革宏)
合作作者：Xun Qian（钱勋）; Jie Gu（谷洁）; Weimin Chen (陈卫民); Xihui Shen (沈锡辉); Shiheng Tao (陶士珩)
主要单位：
西北农林科技大学 (State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Shaanxi Key Laboratory of Agricultural and Environmental Microbiology, College of Life Science, Northwest A&F University, 3 Taicheng Road, Yangling, Shaanxi 712100, People’s Republic of China; Interdisciplinary Research Center for Soil Microbial Ecology and Land Sustainable Productivity in Dry Areas, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100, People’s Republic of China; College of Natural Resources and Environment, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100, People’s Republic of China).
- 摘要 -
化感作用与植物根际生物学过程紧密相连，根际微生物群落对植物的发育十分重要。然而，人们对甘草根际微生物群落受化感物质影响的了解仍不够充分。本研究结合多组学测序和盆栽试验，研究了外源添加化感物质对甘草根际微生物群落的影响，并分析了甘草微生物群落对外源添加化感物质的响应。结果表明外源甘草酸能够抑制甘草的发育，并且重塑了根际微生物群落。在外源甘草酸的添加下，甘草根际富集了特定的具有甘草酸降解能力的细菌。富集的根际微生物主要是鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)，并且在宏基因组中可以组装到鞘氨醇杆菌属菌株的基因组。进一步研究阐明了单菌和合成菌群对甘草酸的降解能力及其对甘草化感作用的缓解效果；结果表明分离到的菌株N(Novosphingobium resinovorum)对缓解甘草幼苗的化感抑制作用具有较强的效果。综上，该研究表明外源添加甘草酸能够模拟甘草的化感自毒作用，甘草根际细菌在缓解甘草的化感作用及维持其幼苗的正常生长中发挥了重要作用。本研究的结果能够增强对甘草化感作用中根际细菌群落动态变化的认识，从而为使用根际细菌微生物肥料解决药用植物连作障碍提供一种可行性的方案。
- 引言 -
化感作用于1937年由Molisch首次提出，他将其定义为植物和/或微生物之间的相互作用。自毒性是化感作用的一种独特形式，植物通过这种形式向环境中释放一类被称作化感物质的化合物，这种化合物会对植物自身生长和发育产生不利影响。通常，化感作用是指化感作用具有自毒性，主要由化感物质驱动，其中大部分是植物的次级代谢产物，如酚类和萜类化合物。化感物质可能通过植物生长过程中的根系分泌、挥发、分解和淋溶作用进入土壤环境。栽培的长期选择增加了药用植物根系次级代谢产物的含量，这使得植物更容易通过根系分泌物释放化感物质。此外，药用植物分泌的化感物质与其根系的次生代谢产物几乎同源。因此，与一般作物相比，药用植物更容易表现出化感自毒作用。化感作用广泛存在于农业生态系统中，例如单一栽培、轮作、间作和连作系统。近年来，随着对药材需求的增加，药材连作种植面积有所增加。在此情况下，连作障碍已成为制约中药农业生产的主要问题，其中化感自毒性是导致中药连作问题的主要因素，对植物生长、产量和品质产生负面影响。因此，在农业生产上迫切需要解决连作障碍的有效策略。
根际是土壤微生物活动和多样性的热点区域，根际分泌物在土壤的狭小空间中对各种微生物造成了影响。大量研究报道了根际微生物群落与植物生长表现（植物营养、生长、抗病性和非生物胁迫的抵抗能力）密切相关。此外，许多研究表明化感作用是涉及供体和受体植物间化合物识别、信号转导的复杂的生物学过程，但是目前对根际微生物群落与化感物质自毒性之间的联系知之甚少。根际土壤被报道是连作系统中最主要的化感物质来源。
近些年，多组学测序技术被广泛用于根际微生物群落研究。宏基因组学分箱技术的发展也使得从复杂环境中获取单菌基因组信息成为可能。宏基因组测序技术也可被用于获取微生物群落中次生代谢产物合成基因的多样性。在此基础上，许多研究阐明了微生物对化感物质的降解作用，例如Phomopsis liquidambari对酚酸的降解和Pseudomonus putida对对香豆酸的降解能够促进竹子生长，类似的降解作用尚未在甘草根际微生物中被报道。甘草是一种多年生草本豆科植物，也是最具药用价值的重要的中国传统草药之一。它含有两种主要的次生代谢物甘草酸和甘草素，具有抗肿瘤作用并具有抗氧化性能。高需求和低供应导致了甘草的连续种植，考虑到甘草连作障碍的发生对生产的限制，筛选具有降解化感物质能力的微生物有助于缓解甘草连作问题，提高甘草产量和土地可持续利用。
因此，在本研究中，我们结合组学分析和盆栽接种试验进行了以下研究：（1）外源化感物质添加对甘草表型和土壤性质的影响以及根际细菌多样性和功能的变化；（2）阐明根际细菌添加对甘草生长的影响。据此，我们推断：(1)特定的根际细菌能够在外源化感物质添加后被富集；（2）这些富集的菌株具有潜在的降解外源化感物质的能力，从而缓解甘草化感作用带来的生长抑制。
- 结果 -
化感物质对甘草生长特性和土壤性质的影响
Variations in licorice plant and soil characteristics under allelochemical addition
研究表明外源化感物质甘草酸能够显著影响甘草的生长状态(图1a)。新鲜叶片中的叶绿素含量在化感物质处理组中显著低于纯水处理的对照组(P < 0.05)。相应的枝和根的重量也有相似程度的降低。衡量植物表型的各项指标随着植物生长不断升高（图1b）。此外，qRT-PCR检测化感物质处理能够在生长中期和末期抑制甘草酸合成相关基因(HMGR, β-AS, CYP88D6)的表达，同时增强了羽扇豆醇合成基因（LUS）的表达。在添加外源甘草酸的末期，CYP72A154 和CHS的表达提均有提高（图1c）。根际土壤的pH随着甘草生长逐渐提升，且在添加外源甘草酸的处理下具有更高的增长量。根际土壤和土体土在纯水处理中具有更高的SWC。化感物质处理组相比纯水处理组具有更高的SOM和TC, 且根际土壤中的提升更小。随着甘草生长，土壤的AN,AP和AK逐渐下降，两种土壤酶（β-G β-glucuronidase, DHA dehydrogenase）的活性在甘草酸添加后也逐渐被抑制。
图1外源甘草酸添加下甘草植株生长表型及主要次生代谢物合成基因的表达谱。
A. 甘草植株表型；B. 甘草植株叶绿素含量，地上和地下部位的鲜重；C. 不同处理和采样阶段甘草根主要次生代谢物合成基因的表达。
化感物质对根际细菌多样性和功能的影响
Varied rhizobacterial diversity and function under allelochemical addition
香农多态性和ACE指数在不同处理中表现出相似的变化趋势，即纯水处理的变化更加显著。根际细菌群落相比土体土具有更高的多样性。群落组成在不同的处理下具有显著差异。不同采样时期对根际细菌组成有更强的影响（Adonis: R2=0.236），对土体土的影响相对较弱(R2=0.224)。相对的，处理类型对土体土的影响更强(R2=0.543)（图2a）。大部分根际细菌分类单元在化感物质处理的中期和末期共富集。通过共富集分类单元的交集筛选出了Persistent taxa（图2b）。通过随机森林模型筛选出8个指示分类单元，其中OTU 7909具有最好的解释度，尽管它的丰度低。这些标志分类单元主要是鞘氨醇单胞菌科（Sphingomonadaceae）（图2c）,富集程度最高的分类单元是属于鞘氨醇单胞菌科科的新鞘磷脂菌属（Novosphingobium）（图2d）。宏基因组测序发现在甘草酸处理组中，中期和末期微生物群落的基因比起始阶段显著富集到146和145个代谢通路。
图2甘草酸添加后根际微生物群落的变化。
A. 不同采样阶段、处理和采样位置微生物群落的主坐标分析；B. 不同处理三个阶段富集和持续性存在物种的Venn图分析。C. 随机森林识别的8个标志细菌科的相对丰度。D. 富集和持续性存在物种的系统发育分析。
不同处理组的差异基因具有相当部分的重合，环状化合物降解相关的基因的丰度有轻微提高（图3a）。宏基因组中组装到74个基因组，其基因组GC含量从26%至72.9%。这些基因组所对应的菌株被鉴定为Mesorhizobium, Noviherbaspirillum, Novosphingobium, Phenylobacterium, Sphingomonas, Streptomyces和and Usitatibacter等属，其中Novosphingobium具有最高的丰度（图3b）。
图3 根际微生物群落的宏基因组学分析及四株分离菌株的基因组学分析。
A. 差异基因的Venn图及功能富集分析。B. 分箱组装到的基因组的基因组特征（GC含量与丰度）。C. 四株单菌分离株的泛基因组学分析；D. 菌株E和N的核心基因组及其功能分类。
接种菌株的分离与构建
Isolation and construction of inoculants
为了进一步探索上述富集和组装到基因组的根际细菌在甘草化感作用中的作用，本研究尝试对这些根际细菌进行分离筛选和培养。培养试验得到了四个单菌培养，分别鉴定为Ensifer sesbaniae (E), Novosphingobium arvoryzae (Na), Novosphingobium resinovorum (N), 和Hydrocarboniphaga effuse (H)。之后通过LC-MS/MS测定了这些微生物降解化感物质的种类和能力。菌株N纯培养添加对化感物质具有最高的降解率（87.94%），其次分别是菌株E, Na和H。不同菌株降解的化合物种类是类似的，包括Ginsenoside Rh, Ginsenoside Rh2, Betulinic acid, Oleanolic acid, 和Ursolic acid, 也包括一些杀菌剂, 包括Cholic acid, Ruscogenin, and Senegenin等。菌株N和E具有更多的外源物质生物降解和代谢相关的基因（图3c,d）。平板培养试验表明菌株N和E间没有明显的营养竞争和拮抗。两者组合(N+E)形成的合成菌群（S）添加对于化感物质的降解率可达92.95%。
不同根际菌株接种后对甘草生长特性的影响
Variations in licorice performance under rhizobacterial inoculants
使用盆栽试验研究了不同根际细菌添加对甘草生长的影响。这些微生物在原先试验采样的土壤中存在，因而可认为是甘草根际细菌的一部分。化感物质处理能够抑制甘草植株的发育（图4）。所有微生物培养物的添加均能够提升植株的生长指数。属于Novosphingobium resinovorum的菌株N在外源添加甘草酸处理组中对甘草植株生长的提升效果最佳。菌株E添加在纯水处理组对甘草植株生长的提升效果最佳。枝的重量在不同处理组中则具有较大的差异(F=288.04, P<0.001)。合成菌群（S）添加在化感物质处理组中的植株生长指数小于纯水处理组。进一步研究发现，微生物添加能够缓解外源化感物质对甘草酸合成基因表达的抑制作用。单菌N,E的添加分别促进了甘草酸合成基因(HMGR, β-AS, CYP88D6) 在化感物质处理和纯水处理组的表达。单菌N的添加还对羽扇豆醇合成基因（CYP72A154, LUS, CHS）的表达具有显著的促进作用。
图4 甘草在不同培养物和外源甘草酸添加组合下的生长表型。
I, 初始采样阶段； A, 化感物质处理; W, 纯水处理; C, 对照组（不加微生物）; N, Novosphingobium resinovorum ; E, Ensifer sesbaniae ; S, 合成菌群. 上图和下图分别为特定采样阶段的单个植株和植株簇的植物生长情况。
- 讨论 -
植物化感作用对植物、土壤和微生物群落的影响，可用外源添加化感物质的方式进行模拟。本研究中，甘草酸处理后富集的根际细菌大多数属于新鞘磷脂菌属（Novosphingobium），新鞘磷脂菌属细菌的基因组也在宏基因组分析中被组装到。新鞘磷脂菌属细菌被报道具有降解多种环状化合物的能力。本研究中发现甘草酸处理中富集的功能基因与环状化合物降解有一定关联。环状化合物降解功能也存在于富集和分离的根际细菌的附属基因组中。由于甘草酸主要为环状结构，因此我们推论分离的根际细菌能够降解甘草酸。栽培试验证明分离得到的根际细菌能够降解甘草酸从而缓解甘草的化感抑制，属于Novosphingobium resinovorum的菌株N在缓解甘草化感抑制中具有最好的效果，这提示了一种通过运用特定根际细菌操纵化感物质降解从而缓解药用植物连作障碍的方法。该研究也增强了对植物根际微生物群落和植物化感物质相互作用的认识。
参考文献
Liu, Y., Wang, H., Qian, X. et al. Metagenomics insights into responses of rhizobacteria and their alleviation role in licorice allelopathy. Microbiome 11, 109 (2023). https://doi.org/10.1186/s40168-023-01511-3
- 作者简介 -
第一作者
西北农林科技大学
刘洋
博士
刘洋，西北农林科技大学生命学院毕业博士研究生，主要关注土壤微生物生态，植物根际微生物生态学的研究。目前已在Microbiome, Journal of Integrative Plant Biology, Environmental Microbiology, Plant and Soil, Science of the Total Environment等期刊发表研究论文。
共同第一作者
西北农林科技大学
王澔
博士
王澔，西北农林科技大学生命学院博士研究生，主要关注微生物基因组进化、全基因组代谢网络、多组学关联分析等生物信息学和系统生物学研究。目前已在Microbiome，Journal of Integrative Plant Biology，Journal of Agriculture and Food Chemistry, Environmental Microbiology等期刊发表研究论文。
通讯作者
西北农林科技大学
韦革宏
教授
韦革宏，西北农林科技大学生命学院教授，博士生导师。“长江学者”特聘教授，国家杰出青年科学基金和全国百篇优秀博士学位论文获得者，万人计划科技创新领军人才，国家“863”计划项目首席专家。长期致力于土壤微生物资源多样性与利用、根际微生物与土壤肥力提升等基础理论与关键技术研究。先后在ISME J、Microbiome、Global Change Biology、Soil Biology and Biochemistry、Environmental Science & Technology等本领域国际知名期刊发表学术论文100余篇，兼任国际根瘤菌与土壤杆菌分类分委员会委员、中国微生物学会普通微生物专业委员会副主任、中国土壤学会土壤生物与生物化学专业委员会副主任。
西北农林科技大学
焦硕
教授
焦硕，西北农林科技大学教授，博士生导师。获国家自然基金委优秀青年基金、陕西省高层次人才引进计划（青年项目）和全国博士后创新人才计划等资助。长期从事土壤微生物生态研究，结合生态系统生态学、地统计学、气候变化科学等多学科手段，通过野外调查取样、原位实验和温室控制实验，运用高通量测序微生物组学及培养组学技术。近五年，围绕“农田土壤微生物群落形成和稳定机制”的科学问题，从“形成-适应-稳定”三个层面，探究农田土壤微生物群落形成模式，阐明农田土壤微生物环境适应性规律，揭示农田土壤微生物群落稳定机制，为农田土壤微生物群落构建与功能调控提供理论依据与途径。相关成果发表在The ISME Journal、Microbiome、Global Change Biology、Global Ecology and Biogeography、Molecular Ecology和Journal of Applied Ecology等期刊。
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