在笔记本上利用vsearch+userach+qiime2搭建流程

软件搭建

1、利用Rstudio作为代码输入端，需要安装R，Rtudio，git

2、下载win版本usearch和vsearch

3、最后qiime2在笔记本上通过虚拟机方式安装。（也可以直接利用usearch提供的silva物种注释数据库，但是没有最新版，而qiime2提供了最新版的silva数据库）

###项目分析流程

###  1、创建文件夹filename，并打开 
    mkdir -p filename
    cd filename

###  2、在filename中创建三个子文件夹，
    mkdir -p seq temp result
    
    ## seq  用于存放原始序列，将测序得到的双端序列文件放入该文件夹中。如果是压缩文件，要对文件进行解压
        
        gzip -d seq/*.gz 
        
###  3、进行第一步分析
        
    ## 3.1 创建metadata.txt文件，创建好后拖入result文件夹中
    
    ## 3.2 metadata.txt文件标准化
        sed -i 's/\r/\n/' result/metadata.txt
        cat -A result/metadata.txt | head -n3   ###文件结尾没有^M，可以进行下一步
        
    ## 3.3 双端序列合并
    time for i in `tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f 1`;do
      vsearch --fastq_mergepairs seq/${i}_1.fq --reverse seq/${i}_2.fq \
      --fastqout temp/${i}.fq --relabel ${i}.
    done &    
    
##################1、如果中间要加入合并好的样品，则依次执行3.4，3.5，3.6；
##################2、如果中间不会加入合并好的样品，跳过3.4，直接执行3.5。在继续执行3.6时，把引物长度替换掉低51行的两个0。（以后美格的样品按此方法执行）
    
    ## 3.4 合并后的序列去引物，并进行质控
    time for i in `tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f 1`;do
      vsearch --fastx_filter temp/${i}.fq \
        --fastq_stripleft 17 --fastq_stripright 21 \
        --fastq_maxee_rate 0.01 \
        --fastqout temp/${i}.fq
    done &
    
    #### (可选)如有其它合并好的样品，把样品放入temp文件夹
    
    ## 3.5 所有样品合并至一个文件
    cat temp/*.fq > temp/all.fq
    
    ## 3.6 第二次质控
    
    ###（如果3.4步不跳过，则执行此条命令）
    time vsearch --fastx_filter temp/all.fq \
      --fastq_stripleft 0 --fastq_stripright 0 \
      --fastq_maxee_rate 0.01 \
      --fastaout temp/filtered.fa
    
    ####（如果3.4步跳过，则执行此条命令）
    time vsearch --fastx_filter temp/all.fq \
      --fastq_stripleft 17 --fastq_stripright 21 \
      --fastq_maxee_rate 0.01 \
      --fastaout temp/filtered.fa
      
    ##查看filtered.fa格式是否正确
    head -n 2 temp/filtered.fa
    grep '>' temp/filtered.fa | head -n4
    
    ## 3.7 序列去冗余 Dereplication和去低丰度序列
    time vsearch --derep_fulllength temp/filtered.fa \
      --output temp/uniques.fa --relabel Uni --minuniquesize 5 --sizeout  --fasta_width 0
    （此处-minuniquesize 参数可以自由调试，当得到的OTU较少时，可以降低该值）

    ls -lsh temp/uniques.fa
    head -n 2 temp/uniques.fa  

    ## 3.8 生成otus.fa
    ../usearch -cluster_otus temp/uniques.fa \
      -otus temp/otus.fa \
      -relabel OTU_
        
    ## 3.9 基于参考去嵌合
    time vsearch --uchime_ref temp/otus.fa \
      -db ~/silva_132.fna \                (此处数据库在silva官网下载)
      --nonchimeras result/otus.fa
    sed -i 's/\r//g' result/otus.fa    
  
    ## 3.10 生成特征表    
    time vsearch --usearch_global temp/filtered.fa --db result/otus.fa \
        --otutabout result/otutab.txt --id 0.97 --threads 4  

    sed -i 's/\r//' result/otutab.txt
    head result/otutab.txt |cat -A    

    ## 3.11 利用qiime2上的数据库进行物种注释
    cd result
    
    conda activate qiime2-2022.2  （此处是在linux服务器上利用conda安装虚拟环境，qiime2官网有详细安装指南）
    
    qiime tools import \
      --input-path otus.fa \
      --output-path otus.qza \
      --type 'FeatureData[Sequence]'

    nohup qiime feature-classifier classify-sklearn \
      --i-classifier ~/silva_138.qza \
      --i-reads otus.qza \
      --o-classification taxonomy.qza &
    
    qza文件解压即可得到

生物信息学学习过程中，软件的安装是一个很头疼的问题，需要学者有强大的自学能力，遇到问题能自己上网搜解决方法。
 

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