3 LDH表征（动物实验1）

1.Zn-LDH的肿瘤保留和分布：

1mg的 Zn-LDH-RITC 瘤周注射给B16F10小鼠。用In Vivo Imaging System FX Pro (VISQUE In Vivo Elite, Korea)在接下来的6天监测Zn-LDH的肿瘤保留能力。

为检测Zn-LDH的生物分布，将1mg的 Zn-LDH-RITC 瘤周注射给B16F10小鼠。24h后收集主要器官和肿瘤并用体内成像系统监测。

为证明Zn-LDH能渗透进肿瘤，1mg的 Zn-LDH瘤周注射给B16F10小鼠，6天后收集肿瘤，用ICP-MS检测肿瘤中的Zn2+水平。Zn-LDH的肿瘤渗透效率通过比较肿瘤中Zn2+ 的量和注射剂量进行计算。用DAPI染核后，用共聚焦观察 Zn-LDH-RITC 在肿瘤切片中的分布。

2.肿瘤pH检测：

在4T1-luc荷瘤小鼠评价NPs对肿瘤酸性的中和。100万4T1-luc接种给Balb/c 小鼠来造模，瘤长到100时，瘤周注射200 μL of LDH or Zn-LDH (1 mg)。一天后静脉注射SNARF-1 (dissolved in 200 μL of saline, 250 μg kg-1) ，30min后手机肿瘤，切一半用体内成像系统进行荧光成像。

3.免疫细胞分析：

从小鼠收集的B16-F10肿瘤和肿瘤引流淋巴结切成小块，并用含5% FBS, 0.5 mg mL-1胶原酶和0.1mg mL-1DNase 的 RPMI 1640介质消化。细胞用荧光标记的抗体PE-Cy7-CD11b, FITC-F4/80, PE-CD80, APC-CD206, PE-NK1.1, APC-CD107a, PE-Cy7-CD3, FITC-CD4 or Pacific Blue-CD8来分析肿瘤中的 TAMs, NK cells and T cells。