常规生信思路内再创新，泛凋亡+分型+预后模型

今天给同学们分享一篇泛凋亡+分型+预后模型的生信文章“PANoptosis-based molecular subtyping and HPAN-index predicts therapeutic response and survival in hepatocellular carcinoma”，这篇文章于2023年6月15日发表在Front Immunol期刊上，影响因子为8.738。

肝细胞癌（HCC）是一种高发的致命癌症。PAN凋亡是细胞程序性死亡的一种新形式，它在HCC中的作用尚未完全明了。本研究的重点是鉴定和分析 HCC 中与泛凋亡相关的差异表达基因（HPAN_DEGs），旨在加深作者对 HCC 发病机制和潜在治疗策略的了解。

1. 识别与癌细胞凋亡相关的差异表达基因并进行功能分析

泛凋亡基因集包括热凋亡（27个基因）、细胞凋亡（259个基因）和坏死（15个基因）（图1A、B）。HCC的差异表达基因包括TCGA数据库筛选的5663个肝细胞癌差异表达基因和IGCG数据库筛选的4587个肝细胞癌差异表达基因（图1C、D）。作者将 TCGA、ICGC和泛凋亡筛选出的三个基因集进行映射，得到 69 个基因，定义为与 泛凋亡 相关的 HCC 差异表达基因（HPAN_DEGs）（图 1E, F ）。

图1 鉴定与泛凋亡相关的 HCC 差异基因

作者进行了GO、KEGG和GSEA富集分析，以研究HPAN_DEGs的生物学功能和相关信号通路。生物过程（BP）分析表明，HPAN_DEGs主要富集于信号转导、细胞通讯、白介素-1介导的信号通路和RNA稳定性调控（FDR<0.1，P值<0.05，图2A）。分子功能（MF）分析表明，HPAN_DEGs 主要富集于蛋白质结合、酶结合、酶调节活性和转录因子结合（FDR<0.1，p 值<0.05，图 2B）。细胞组成（CC）分析表明，HPAN_DEGs主要富集在蛋白酶体复合物、内肽酶复合物、肽酶复合物和细胞膜中（FDR<0.1，p值<0.05，图2C）。KEGG富集分析表明，HPAN_DEGs主要富集在蛋白酶体、细胞凋亡、细胞周期、坏死、p53信号通路、白金抗药性和其他信号通路中（FDR<0.1，p值<0.05，图2D）。

图2 HPAN_DEGs 的 GO/KEGG/GSEA 富集分析

为了进一步明确HPAN_DEGs承担的生物学功能，作者分别利用KEGG、Hallmark和Reactome数据集对HPAN_DEGs进行了GSEA分析。结果表明，HPAN_DEGs主要富集于P53信号通路（Hallmark和KEGG）、活性氧通路（Hallmark）、细胞周期（Reactome和KEGG）、DNA修复（Hallmark和Reactome）（NES>1，P值<0.05，FDR<0.25，图2E-G）。总之，作者的研究发现了69个与PAN凋亡相关的HCC差异表达基因（HPAN_DEGs），并揭示了它们在各种生物学功能和信号通路中的富集，如P53信号通路、DNA修复和细胞周期，表明它们可能参与了肿瘤的生长、转移和耐药性。

2.&nbsp;HPAN_DEG表达谱分析确定了三种预后不同的HCC亚型

根据 69 个 HPAN_DEGs 的表达谱信息，作者应用一致性聚类分析对 TCGA 的 HCC 队列进行了分组。当 K 值取为 3 时，组内的平均一致性较高，同时确保 CDF 曲线线下的面积尽可能大（图 3A、B）。作者将各组命名为亚型1（n = 131）、亚型2（n = 160）和亚型3（n = 74）（图 3C）。然后，作者比较了三个群组之间 PAN 凋亡基因的表达水平，发现与亚型1 和亚型3 相比，PDK4 基因在亚型2 中上调，而与亚型1相比，SFN 基因在其他两个群组中下调（图 3D）。此外，生存分析表明，这三种亚型的 HPAN_DEGs 表现出不同的临床预后结果，亚型1 的总生存率最差，亚型2最好，亚型3介于两者之间（图 3E）。总之，本研究基于69个HPAN_DEGs 的表达谱，应用聚类分析确定了三种不同的 HCC 亚型，这些亚型表现出泛凋亡基因的不同表达和不同的临床预后结果。

图3 HPAN_DEG表达谱分析确定了三种具有不同预后的HCC亚型

3.&nbsp;HPAN_DEGs 亚群中不同的免疫学特征和突变景观

以前的研究表明，泛凋亡&nbsp;可能会影响肿瘤突变和免疫浸润。为了评估 HPAN_DEGs 亚组之间的免疫学特征，作者使用多种免疫学算法（包括 CIBERSORT、ESTIMATE 和 xCELL）对三个亚组分别进行了免疫学景观分析。图 4A 的瀑布图说明了 TCGA 训练集中 22 个免疫细胞的分布情况。然后，作者评估了 HPAN_DEGs 亚组的免疫得分（Immune-Score）、基质得分（Stromal-Score）和微环境得分（Microenvironment-Score）（图 4B, C ）。研究表明，亚型2 在免疫得分和基质得分方面与其他两组有显著差异（亚型2 vs. 亚型1，0.04 ± 0.05 vs. 0.06 ± 0.07，P = 0.03；亚型2 vs. 亚型3，0.04 ± 0.05 vs. 0.06 ± 0.07，P = 0.03）。免疫得分）（亚型2 vs. 亚型1，0.12 ± 0.06 vs. 0.06 ± 0.04，P = 7.9E-19；亚型2 vs. 亚型3，0.12 ± 0.06 vs. 0.07 ± 0.05，P = 0.00000000073，基质得分）。在微环境得分评估中，作者发现亚型2和亚型3没有统计学差异，而亚型1与其他两组有显著差异（亚型1 vs. 亚型2，0.12 ± 0.085 vs. 0.16 ± 0.09，P = 0.0000017；亚型1 vs. 亚型3，0.12 ± 0.08 vs. 0.17 ± 0.16，P = 0.03，图4F）。作者还评估了HPAN_DEGs亚群中免疫检查点的基因表达，即PD-1（PDCD1）、PD-L1（CD274）、PD-L2（PDCD1LG2）、CTLA4、LAG3、TIGIT、HAVCR2，发现这些免疫检查点在亚型1和亚型3中表达上调，而在亚型2中表达下调（均P＜0.05，图4H）。

图4 HPAN_DEGs 亚群中不同的免疫学特征和突变景观

随后，作者展示了 HPAN_DEGs 亚组的体细胞突变情况。三个亚群中突变率最高的 15 个基因分别是 TP53/CTNNB1/TTN/MUC16/ALB/PCLO/MUC4/RYR2/ABCA13/APOB/CSMD3/LRP1B/FLG/OBSCN/AXIN1。突变率最高的基因是 TP53，三个群组的突变率各不相同，亚群1（44.79%）的突变率分别高于亚群2（23.96%）和亚群3（29.17%）（图 4D）。肿瘤突变负荷（TMB）是衡量癌症突变数量的重要指标，也是评估 PD-1 抗体疗效的新型标记物。作者比较了三个亚群的肿瘤突变负荷（TMB），发现亚型2的TMB分别低于亚群1和亚群3（亚群2 vs. 亚群1，1.84 ± 1.34 vs. 2.85 ± 3.99，P = 0.0042；亚群2 vs亚群3，1.84 ± 1.34 vs2.50 ± 2.08，P = 0.00034，图4E）。然后，作者用三元图显示了突变基因在 HPAN_DEGs 不同亚群中的分布情况（图4G）。总之，作者的研究结果表明，免疫检查点的表达和突变情况在三个群组中存在巨大差异，这可能会对癌症免疫疗法产生重要影响。

4.&nbsp;构建基于 HPAN_DEGs 的 泛凋亡 风险评分模型，用于 HCC 预后评估

为了进一步评估HPAN_DEGs对生存预后的影响，作者利用LASSO、单变量和多变量回归筛选出9个与预后相关性较强的基因特征，并最终构建了肝细胞癌的泛凋亡风险指数（HPAN-index，图5A-D）。作者利用 HPAN 指数评分（高 183 对低 182）将训练集中具有完整生存信息的 365 例患者分为高 HPAN 指数组和低 HPAN 指数组。Kaplan-Meier 分析显示，在训练集中，低风险组的预后（中位生存时间，MST = 83.8 个月）明显优于高风险组（MST = 29.9 个月）（P < 0.001，图 5E）。作者研究了患者预后、基因表达和 HPAN-index 之间的关系，观察到随着 HPAN-index 的增加，生存率显著下降。正如预期的那样，CHMP2A/PSMA4/PSMD3/TP53BP2 是保护因素，其表达随着 HPAN-index 的增加而下调，而 IRAK1/PSMD11/PTRH2/SFN/YWHAB 则是危险因素（图 5F）。

图5 构建基于 HPAN_DEGs的泛凋亡风险评分模型，用于HCC预后评估（HPAN-index）

此外，作者还评估了 HPAN 指数作为预测模型的曲线下面积（AUC），结果表明 HPAN 指数在预测 1 年、3 年和 5 年的生存率方面具有很高的准确性（图 5G）。作者应用 Sankey 图直观地显示了 HPAN 指数风险组与个体临床特征之间的关系，结果表明，亚型1 主要聚集在高 HPAN 指数组。与此相反，亚型2 主要聚集在 HPAN 指数低的一组（图 5H）。有趣的是，TNM 分期中的 I/II 期主要聚集在 HPAN 指数低的一组，而 III/IV 期主要聚集在 HPAN 指数高的一组。作者根据 Cox 回归分析结果构建了一个提名图，发现 HPAN 指数是一个独立的风险因素（图 5I）。总之，通过LASSO回归、单变量和多变量回归分析构建的基于HPAN_DEGs的泛凋亡风险评分模型（HPAN-index）能够准确预测肝细胞癌患者的生存预后，可作为临床决策的潜在独立风险因素。

5.&nbsp;HPAN指数作为HCC患者预后预测指标在多个队列中得到验证

为了检验 HPAN-index 模型作为预测模型的可重复性，作者在 ICGC_HCC 队列（验证集）和 GSE14520 队列（测试集）中验证了该模型。应用 Kaplan-Meier 分析，作者可以观察到随着 HPAN 指数的增加，患者生存率显著下降（图 6A、C）。在验证集中，低 HPAN 指数组的预后（MST = 66.7 个月）明显优于高 HPAN 指数组（MST = 47.3 个月，P < 0.001，图 6B），测试集中的结果与此类似（P = 0.01，图 6D）。总之，在验证组和测试组中，HPAN-指数模型对患者的生存都有显著的预测价值，HPAN-指数得分越高，预后越差。

图6 HPAN指数作为HCC患者预后预测指标在多个队列中的验证

6.&nbsp;与 HCC 患者 HPAN 指数相关的免疫细胞图谱和分子通路

为了进一步研究不同 HPAN 指数组的免疫特征，作者采用了五种不同的免疫算法，包括 CIBERSORT、ESTIMATE、TIDE、TIMER 和 xCell，来评估 HPAN 指数与免疫微环境之间的关系。图 6E、F 的结果显示，HPAN 指数与多种免疫细胞的表达存在显著相关性，包括 B 细胞幼稚型、B 细胞记忆型、T 细胞 CD8 型、T 细胞 CD4 记忆激活型、T 细胞滤泡辅助型、T 细胞调节型、T 细胞 gamma delta 型、NK 细胞静息型、NK 细胞激活型、单核细胞、巨噬细胞 M0 型、肥大细胞静息型和中性粒细胞，所有 P 值均小于 0.05。此外，与低HPAN指数组相比，高HPAN指数组的基质得分、免疫得分和ESTIMATE得分都明显更高（均P<0.05，图6G）。值得注意的是，微卫星不稳定性（MSI）评分是反映肿瘤基因组稳定性的重要指标，与免疫检查点疗效有显著相关性（56）。根据作者的分析，作者观察到与低HPAN指数组相比，高HPAN指数组的MSI-分数明显更高，其他分数如TIDE-分数、IFNG-分数、Merck18-分数、Dysfunction-分数、Exclusion-分数、MDSC-分数和TAM M2-分数也有类似的结果（均P＜0.05，图7A-F）。与低HPAN指数组相比，高HPAN指数组的免疫检查点表达水平显著上调，包括CD274、CTLA4、LAG3、TIGIT、HAVCR2、PDCD1和PDCD1LG2（均P＜0.05，图7H）。这一观察结果表明，与低HPAN指数组相比，高HPAN指数组可能更容易从免疫疗法中获益。

图7 与HPAN指数相关的HCC患者免疫细胞格局和分子通路。

为了进一步阐明不同HPAN指数组的分子机制，作者进行了GSVA富集分析。结果显示，高HPAN指数组明显富集于信号通路，如T细胞受体通路、趋化因子通路、B细胞受体通路、DNA复制和细胞周期。相比之下，低 HPAN 指数组在脂肪酸代谢、药物代谢、甘氨酸丝氨酸、苏氨酸代谢、PPAR 信号通路和色氨酸代谢相关的信号通路中表现出明显的富集（图 7G）。作者进一步评估了不同HPAN指数组的药物敏感性，发现与高HPAN指数组相比，小分子抑制剂（JAK1_8709/KRAS_G12C/林西替尼/尼罗替尼/奥沙利铂/尼拉帕利/皮可酸/塞卢米替尼/索拉非尼）在低HPAN指数组的敏感性明显更高（均P＜0.05）。总之，HPAN指数高的患者可能对免疫检查点疗法更敏感，而HPAN指数低的患者可能更适合靶向药物。

7.&nbsp;验证HPAN指数并确定索拉非尼耐药性的关键分子YWHAB

为了进一步验证HPAN-index在预测耐药性方面的准确性并探索关键分子，作者将TCGA中基因表达数据的相关性分析结果与蛋白-蛋白相互作用（PPI）拓扑网络分析结果相结合，确定了在HPAN-index中权重较高的YWHAB（图8A、B）。随后，作者利用DepMap数据库选择了YWHAB表达水平最高的PLCPRF5细胞，构建索拉非尼耐药细胞（resis-PLC）（图8C、D）。作者欣喜地发现，在 resis-PLC 中敲除 YWHAB 不仅恢复了对索拉非尼的敏感性，而且比非耐药对照组的敏感性更高（IC 50 ，NC_PLC 7.265 μM，resis-PLC 11.01 μM，siYWHAB 4.288 μM，图 8E、F）。如图 8G、H 所示，YWHAB 的敲除恢复了索拉非尼对 resis-PLC 侵袭的抑制能力。此外，作者还在公共数据库中进一步验证了 HPAN 指数，结果显示，与高 HPAN 指数组相比，低 HPAN 指数组对索拉非尼更敏感，对免疫疗法的反应性更低（图 8I-L）。总之，HPAN 指数在预测对免疫疗法的反应和对靶向药物的敏感性方面具有相当大的优势，YWHAB 可能在 HPAN 指数的功能中起着至关重要的作用。

图8 HPAN-index 的验证和索拉非尼耐药关键分子 YWHAB 的鉴定

总结

总之，作者筛选了肝细胞癌中与泛凋亡相关的差异表达基因（HPAN_DEGs），从而确定了在预后、突变情况和免疫浸润方面表现出不同特征的三个亚组。这些亚组还表现出 SFN 和 PDK4 的差异表达，这可能有助于更好地理解肝细胞癌的生物学基础。此外，作者还开发了 HPAN指数，该指数与生存预后、对小分子靶向药物的敏感性以及对免疫疗法的反应高度相关。作者希望应用这一模型能够识别出更适合免疫疗法或靶向疗法的个体。这项研究为HCC的个性化精准治疗提供了一种新策略，并可能为今后研究该疾病的泛凋亡机制提供启示。