RNA-seq定量分析学习笔记

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RNA-seq技术革命性地改变了转录组学研究，使研究者能够以前所未有的深度和范围来探索基因表达。在RNA-seq数据的处理流程中，比对后的定量分析步骤至关重要，它涉及将测序产生的reads准确地映射到基因或转录本上，并据此量化它们的表达水平。

1. 定量步骤的重要性

定量分析的目的是要从生物学的角度理解基因如何在不同的条件、不同的细胞类型或不同的发育阶段中表达。这一步骤不仅是理解基因表达调控的关键，也是发现新基因、识别转录本异构体以及探究基因功能的基础。在比对完成后，定量分析涉及将reads计数并归一化，这一过程需要考虑多种因素，包括但不限于reads的长度、比对质量以及样本间的差异。

定量分析的挑战在于，reads的分布并不总是均匀的，而且某些reads可能同时映射到多个位置或多个基因。因此，定量分析工具必须能够处理这些复杂情况，并准确地将reads分配给相应的基因或转录本。

2. 常用工具介绍：HTSeq-count和FeatureCounts

HTSeq-count

HTSeq-count是一种流行的Python库，广泛用于RNA-seq数据的定量分析。它通过对比对文件进行逐行扫描，将reads分配给特定的基因或转录本。HTSeq-count的独特之处在于其灵活性和精确性，特别是在处理复杂的剪接模式和重叠基因时。

• 原理：HTSeq-count使用用户提供的注释文件（如GTF格式），识别基因或转录本的位置，并根据reads与这些特征的重叠情况来分配reads。它提供了多种分配策略（如union、intersection-strict等），让用户可以根据具体的实验设计和研究需求选择最合适的策略。

FeatureCounts

FeatureCounts是Subread软件包的一部分，它以其高效率和用户友好性而受到广泛欢迎。FeatureCounts能够处理大规模的数据集，并支持多线程，从而大大加快了定量分析的速度。

• 原理：类似于HTSeq-count，FeatureCounts也是通过比对文件和注释文件来分配reads。它的核心算法非常高效，能够快速处理成千上万的reads。FeatureCounts特别适合用于标准化的基因表达研究，例如差异表达分析。

3. 定量水平介绍

• Exon级别定量：在外显子（exon）级别的定量分析中，重点在于计算每个外显子的reads覆盖度。这对于研究剪接变异和外显子使用的动态变化尤为重要。
• Transcript级别定量：在转录本（transcript）级别的定量中，重点是区分和量化同一基因的不同转录本。这需要更精细的注释信息和更复杂的算法。
• Gene级别定量：Gene级别的定量是最常见的RNA-seq数据分析方法。在这个水平上，所有映射到同一个基因的reads被累加起来，形成该基因的整体表达水平。

4. HTSeq-count使用及参数解释

HTSeq-count是一种常用于RNA-seq数据定量分析的工具。它可以在不同的生物学水平（如exon、gene、transcript）上进行定量分析。

示例代码及解释

基因水平定量（Gene-level）：

htseq-count -f bam -r pos -s no -i gene_id aln.bam genes.gtf > gene_counts.txt

• -f bam：指定输入文件格式为BAM。
• -r pos：指定reads在参考序列上的顺序（按位置排序）。
• -s no：指定非链特异性测序。
• -i gene_id：指定GTF文件中用于识别基因的属性。
• aln.bam：输入的比对文件。
• genes.gtf：注释文件。
• gene_counts.txt：输出文件，包含基因水平的计数。

链特异性单链测序（Single-end, strand-specific）：

htseq-count -f bam -r pos -s reverse -i gene_id aln.bam genes.gtf > gene_counts.txt

• -s reverse：指定链特异性测序，适用于单链测序。

链特异性双链测序（Paired-end, strand-specific）：

htseq-count -f bam -r pos -s reverse -i gene_id aln_pe.bam genes.gtf > gene_counts.txt

• aln_pe.bam：双链测序的比对文件。

5. FeatureCounts使用及参数解释

FeatureCounts是用于快速而准确地对RNA-seq reads进行定量分析的工具，可以在不同水平（exon、gene、transcript）上进行定量。

示例代码及解释

基因水平定量（Gene-level）：

featureCounts -T 8 -t exon -g gene_id -a genes.gtf -o gene_counts.txt aln.bam

• -T 8：指定使用8个线程。
• -t exon：指定定量的特征类型为外显子。
• -g gene_id：指定用于计数的基因ID。
• -a genes.gtf：注释文件。
• -o gene_counts.txt：输出文件名。
• aln.bam：输入的比对文件。

链特异性单链测序（Single-end, strand-specific）：

featureCounts -T 8 -t exon -g gene_id -s 1 -a genes.gtf -o gene_counts.txt aln.bam

• -s 1：指定单链测序的链特异性模式。

链特异性双链测序（Paired-end, strand-specific）：

featureCounts -T 8 -t exon -g gene_id -p -s 1 -a genes.gtf -o gene_counts.txt aln_pe.bam

• -p：指定输入文件为双链测序。
• aln_pe.bam：双链测序的比对文件。

总结

RNA-seq基因组比对是转录组研究的关键步骤，它涉及将RNA-seq产生的短序列读取（reads）准确地映射到参考基因组上。这个过程充满挑战，包括处理高度多样化的序列、剪接事件、测序错误和短读长带来的限制。在解决这些挑战方面，HTSeq-count和FeatureCounts等高效的比对工具发挥着重要作用。

希望这篇学习笔记对你有所帮助！如果有任何问题或需要进一步的指导，请随时联系我。