客户文章 | Plant Physiology：RNA-seq（转录组测序）和DAP-seq技术联合应用于OsCCA1通过ABA信号调控水稻适应非生物胁迫机制研究

中科院植物所在Plant Physiology期刊上发表了题为“Rice CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1 transcriptionally regulates ABA signaling to confer multiple abiotic stress tolerance”的研究成果。

该研究揭示了OsCCA1调控水稻适应盐胁迫、干旱胁迫以及渗透胁迫的分子机制。其中，该研究使用了DNA亲和纯化测序技术（DAP-seq，DNA Affinity Purification Sequencing），鉴定了水稻生物钟核心组分OsCCA1（Oryza sativa CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1）调控的下游靶基因。

研究背景
生物钟组分和脱落酸（Abscisic Acid，ABA）在调控植物生长发育和适应逆境胁迫过程中具有重要作用，但生物钟组分是否参与ABA信号转导，目前还不清楚。
研究材料
野生型水稻材料Dongjin（DJ）和OsCCA1功能缺失的突变体水稻（oscca1-L1和oscca1-L2）
研究结果

图1. 使用DAP-seq方法，在全基因组水平上鉴定OsCCA1的直接结合靶点。
A. 使用DAP-seq鉴定的OsCCA1关联的基因数量及在全基因组的分布图。
B. 使用MEME-CHIP分析OsCCA1结合的motif。
C和D. 使用EMSA验证OsCCA1与SRZ1基因和OsPP2C09基因启动子区的AAATATC motif的结合。
E. 使用DAP-seq鉴定的OsCCA1关联基因KEGG富集结果。

图2. 使用RNA-seq发现OsCCA1调节ABA响应基因的表达。
A. oscca1-L1突变体与Dongjin (DJ)相比，上调和下调基因的数量。
B. 盐胁迫条件下oscca1-L1中DEGs富集最多的15个GO term。
C. oscca1-L1突变体中DEGs与ABA响应基因重叠的基因数量。红色和蓝色箭头分别表示上调和下调的基因。
D. 热图显示（C）中19个ABA响应基因的转录丰度。
E. 盐胁迫下oscca1-L1中的DEGs重叠的OsPYLs基因（左）、A类OsPP2Cs基因（中）、SnRKs/SAPKs基因（右）。红色和蓝色箭头分别代表表达上调和下调的基因。

图3. OsCCA1直接调控ABA响应基因的表达。
A. 比较DAP-seq鉴定的靶基因与RNA-seq结果中，oscca1突变体中已鉴定的DEGs，将重合的基因作为OsCCA1的直接靶基因。
B. OsCCA1靶基因的前15个富集的GO term。
C. OsCCA1直接激活的靶基因与A类OsPP2C基因重叠的基因。oscca1突变体与DJ中5个重叠基因的转录丰度。
D. 通过DAP-seq检测的OsCCA1在OsPP108p（-2625 bp）上结合峰（重复1和重复2）和阴性对照（mock）。
E. OsbZIP46是OsCCA1的靶基因，而且是OsCCA1突变体中下调基因和盐胁迫反应基因中唯一的基因。
F. 通过DAP-seq检测到的OsCCA1在OsbZIP46（-1263 bp）上结合峰(重复1和重复2)和阴性对照（mock）。

图4. OsCCA1直接结合OsPP108和OsbZIP46的启动子，并激活其转录。
A. 在正常条件和NaCl处理24小时后，Dongjin (DJ)和oscca1-Ls植株中OsPP108(左)和OsbZIP46(右)的转录水平。
B. 水稻原生质体瞬时表达实验表明，OsCCA1可激活OsPP108和OsbZIP46的转录活性。
C和D. ChIP-qPCR检测显示OsCCA1结合OsPP108和OsbZIP46的启动子。
E和F. EMSA结果显示OsCCA1直接结合OsPP108和OsbZIP46启动子的rCBS基序。

结论
本研究使用DAP-seq和RNA-seq方法，揭示了水稻生物钟核心组分OsCCA1通过直接结合和调控OsPP2Cs和OsbZIP46基因来协调ABA信号网络增强水稻对多种非生物胁迫适应性的分子机制。该研究为生物钟调控水稻耐逆性提供了新的理论依据，为研发具有多重抗逆性的水稻品种提供了设计育种的靶点和优质遗传资源。

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