文章分享 | Ribo-seq与RNA-seq联合分析揭示uAUG-ds翻译调控机制

技术简介

RNA-seq主要从转录组水平分析基因的表达调控机制，检测用于核糖体翻译的RNA序列及二级结构。Ribo-seq主要用于检测核糖体翻译的起始位置、翻译富集区和翻译终止位置。RNA-seq与Ribo-seq联合分析可以准确检测mRNA上游5’UTR区的uORFs翻译调控结构，揭示生物模式触发免疫下的翻译调控机制。

文献速递

2023年发表在Nature上的“Pervasive downstream RNA hairpins dynamically dictate start-codon selection”文章，发现在uORFs区的uAUGs下游存在双链结构，可动态调节mORFs区蛋白的表达。文章主要提出了对防御性蛋白表达基因（顺势作用）的两种调节状态：

1. 正常情况下，uAUG-ds结构诱导核糖体选择性翻译uORF，抑制下游mORFs翻译，抑制防御性蛋白的表达。
2. 在受到免疫攻击后，诱导RNA解旋酶将uAUG-ds结构打开，使核糖体可以绕过uAUGs，翻译下游防御蛋白。

研究首先对正常处理和elf18诱导免疫处理的拟南芥样本进行RNA-seq和Ribo-seq测序。综合RNA-seq数据和Ribo-seq数据，对检测到的25,554个可表达的转录物进行分析，筛选得到13,051个mAUGs上游5’UTR含有uAUGs的可表达转录物（含有uAUGs）。对比正常处理和elf18处理样本的翻译效率（TE），将这13,051个转录物分为TE-up、TE-nc和TE-down三组，通过GO分析发现了TE-up组基因与相应环境胁迫等生物过程有关，而TE-down组基因主要是与生长相关代谢过程有关（Extended Data Fig.2）。

Extended Data Fig. 2 Global analysis of translational dynamics and dual-luciferase reporter study of uAUG-containing transcripts.

为了鉴定uAUGs在翻译调控中的作用，研究又从这13,051个转录物中筛选出翻译型uAUGs，发现翻译型uAUGs在TE-up组中显著富集，表明了uAUGs在调节免疫相关翻译中具有普遍作用（Fig. 1b）。研究还对比了正常处理和elf18诱导免疫处理下，TE-up组转录物中的翻译型uAUGs特征，发现在正常处理下翻译型uAUGs的翻译起始率较高（核糖体占有率），而elf18处理后这种类型的uAUGs翻译起始率显著降低（Fig. 1e）。由于uAUGs起始的翻译通常会抑制下游mORFs翻译，所以在elf18处理下uAUGs起始的翻译的减少也解除了对下游mORFs翻译的抑制作用。

Fig. 1 Translational dynamics of uORF-containing transcripts.

为了确定uAUGs影响翻译起始的机制，研究首先评估了所有表达转录本中的Kozak序列（一级结构），发现mAUGs比uAUGs仍具有更好的Kozak序列，而且TE-up、TE-nc和TE-down转录物中翻译型uAUGs的Kozak序列也是相似的（Fig. 2a），表明了在TE-up转录物中elf18介导的从uAUGs到mAUG的翻译起始的转换还与其他序列结构有关。研究下一步使用SHAPE-MaP法来探究RNA二级结构对翻译起始识别的影响。研究定量检测了细胞内的RNA结构，发现具有较高SHAPE反应的区域更可能是单链结构。研究进一步使用正常处理和elf18处理样本中mRNAs的数据进行结构建模，发现尽管5’UTR取和CDSs区在SHAPE反应上是相似的，但在所有表达转录物中mAUGs下游双链结构或蛋白质结合水平较高（低SHAPE反应）（Fig. 2b）。研究同时对上下游核苷酸SHAPE反应分析发现，mAUGs和翻译型uAUGs下游比上游表现出明显的低SHAPE反应，而非翻译型uAUGs没有这种现象（Fig. 2c）。研究又对比了正常处理下和elf18处理下的不同转录效率（TE-up、TE-nc和TE-down）转录物种的uAUGs的SHAPE反应情况，发现正常处理下TE-up转录物中的翻译型uAUGs下游具有较低的SHAPE反应，表明了uAUGs下游存在二级结构。研究通过缺乏蛋白质实验，排除蛋白质结合导致低SHAPE反应，进一步确认了双链RNA二级结构（mAUG-ds和uAUG-ds）影响翻译起始调控的可能性。

为了直接观察结构模式与AUGs的翻译起始的关系，研究开发了基于一级序列和结构数据的TISnet模型，来预测翻译的起始位点。经过mAUGs和internal AUGs数据训练的模型，可以预测到翻译型uAUGs和非翻译型uAUGs之间存在显著差异（Extended Data Fig. 5d）。模型预测出的起始型uAUGs下游序列比非起始型具有更高的负折叠自由能（易形成二级结构）（Fig. 2e）和更高的核糖体占有率（Fig. 2i），表明TISnet模型也可以准确预测翻译型uAUGs。以上研究表明了在正常情况下，AUGs下游RNA二级结构可以促进该位置的翻译起始，与上游RNA二级结构抑制翻译起始相反。

Fig. 2 Global SHAPE-MaP and deep learning analyses reveal hairpin structures downstream of mAUGs and uAUGs that have a role in dictating translation initiation.

通过分析Ribo-seq数据，研究发现了TE-up转录物中elf18处理可以启动uORFs翻译起始到mORFs翻译起始的转变。首先是观察到在elf18处理下uAUGs下游SHAPE反应增加（二级结构解链），并且TE-up转录物uAUG-ds结构变化受免疫诱导影响程度更大（Fig. 3a）。研究提出了假设，免疫诱导降低了uAUG-ds结构复杂性，启动下游mAUGs的翻译。研究进一步通过构建uAUG2-ds突变表达系统，验证了uAUGs下游双链结构有助于通过促进uAUGs的翻译起始来抑制uORF介导的下游mORF翻译。研究者还在植物和人细胞系中证实了这些结果，并通过对肿瘤抑制基因的突变体分析，发现了抑制BRCA1的mRNA翻译的uAUGs-ds结构（Fig.3g right）。

Fig. 3 RNA secondary structures downstream of uAUGs dynamically regulate translation.

接下来研究者试图去了解elf18诱导是如何促进uAUGs-ds解旋的。研究者主要选择了DEAD-box RNA解旋酶进行研究，发现免疫诱导的解旋酶表达水平增加可能促进uAUGs-ds的解旋，从而降低uAUG介导的mORF翻译的抑制。研究通过构建解旋酶表达系统证实了elf18诱导的RNA解旋酶参与了TE-up转录物中uAUG-ds的解旋，并促进了下游防御蛋白的表达。

小结

研究使用RNA-seq、Ribo-seq和深度学习算法联合分析了转录组范围的翻译和结构特征，并且将结果扩展到其他生物体中，揭示了uAUG-ds作为调节基因表达的分子开关，动态调节防御性蛋白基因及肿瘤抑制基因的表达。