经典文章|配合单细胞的组学看过来！_single-cell transcriptome atlas and regulatory dyn-CSDN博客

本文链接：https://blog.csdn.net/SHANGHAILINGEN/article/details/138118063

华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室在《Advanced Science》期刊上(IF=15.1)发表了题为“Single-Cell Transcriptome Atlas and Regulatory Dynamics in Developing Cotton Anthers”的研究论文，通过对单细胞测序结果进行分析，揭示了高温影响花粉壁形成导致雄性不育的新机理，为后续培育出耐高温种质提供了理论基础。

期刊：Advanced Science

影响因子：15.1

发表时间：2023.11

样本类型：棉花花药

一、研究背景

高温胁迫导致植物花药花粉败育，严重威胁作物产量。然而，花药发育和高温（HT）反应的空间表达图谱和调控动态仍很大程度上未知。本文首次建立了棉花花药中的单细胞转录组图谱和染色质可及性调查，描述了花药每种细胞的特异性表达和表观遗传格局。减数分裂细胞、绒毡层细胞和中间层细胞发育轨迹的重建不仅识别了新的表达基因，揭示了绒毡层细胞在四分体阶段的快速功能转变。总之，本研究为花药提供了大量的信息，并为耐热作物的创造提供了线索。

二、主要结果

1、棉花花药发育过程中的单细胞转录组图谱的构建和花药中细胞类型的鉴定

对四分体时期的棉花花药进行单细胞核转录组测序（图1A）。根据测序分析结果建立了一个具有18个细胞簇的四分体阶段花药的单细胞转录图谱，且花药细胞间具有明显的表达特征（图1B-D）。然后对花药细胞图谱进行细胞簇注释。如簇4为中间层细胞（图1E-F）。

图1 棉花四分体时期花药单细胞转录组图谱的构建

2、棉花花药中间层细胞发育轨迹

为了解减数分裂之前（第7期之前）花药中间层细胞的程序性细胞死亡（PCD）过程，对中间层发育的发育轨迹进行了分析。首先，重新聚类中间层细胞并将其分为三个亚簇细胞，然后对其沿着重建的中间层发育轨迹进行排序，结果显示从亚簇ML1、亚簇ML2到亚簇ML3的逐渐过渡（图2B-D）。将ML1定义为该轨迹的起点。沿着发育轨迹，确定了每个拟时序簇内特异表达的大量新基因（图2E）。另外，随着棉花绒毡层的发育，中间层开始变得延长，并最终在第11阶段完全消失（图2G）。

图2 中间层细胞的发育轨迹

3、重建绒毡层细胞的连续发育轨迹

为了解绒毡层细胞在四分体期的发育过程，选择绒毡层细胞簇2、5、7和10来重建绒毡层的发育轨迹（图3A）。根据UMAP上的分布距离，重建的轨迹显示了从簇2到簇10的快速转变（图3B、C）。在发育轨迹中，每个拟时序簇内的有大量特异表达基因，如转运类基因（图3D、F），这些簇富集了多个信号传导途径（图3H）。进一步构建了首个单细胞水平的植物绒毡层发育过程中转录因子间的调控网络，发现一些在绒毡层发育过程中起重要作用的新转录因子如MYB4、MYB52、ZFN1等（图3H，I）。

图3 绒毡层细胞发育轨迹

4、染色质可及性揭示棉花花药单细胞调控动力学

为了全面阐明花药细胞类型之间的表达异质性，利用多组学（ATAC+RNA）单细胞测序技术，获得了常温（NT）样品细胞中表达和染色质开放性信息。NT样品中的scRNA-seq中的基因表达与scATAC-seq中的基因活性得分高度一致（图4A，B）。此外，还鉴定到了大量特异细胞类型的可及染色质区域（ACR）（图4C），并对这些ACR进行注释，确定了一组具有特异ACR的标记基因。然后测量了NT条件下TF结合motif的染色质开放性，发现MYB相关TF家族的motif染色质开放性在绒毡层细胞中最高，这表明MYB TF对调控绒毡层发育十分重要（图4D、E）。

图4 棉花花药中NT作用下的单细胞染色质可及性

5、高温对花粉壁形成的绒毡层细胞有破坏作用

高温可以导致作物严重减产，为了了解不同花药细胞类型对高温的响应。对高温处理（HT）四分体期花药样本进行snRNA-Seq，并与前面正常温度（NT）的结果比较。分析发现在高温条件下绒毡层细胞的数量明显减少（图5A），而表皮细胞和结缔组织细胞数量增加（图5B）。进一步对NT和HT之间的不同细胞类型进行了差异表达分析和富集分析，发现上调基因簇的基因富集路径包括“细胞热适应”、“衰老”等（图5C，D）。而绒毡细胞的“花粉外壳形成”、减数分裂细胞的“DNA复制”、中间层细胞的“钙离子跨膜转运”被抑制（图5C，E）。

图5 花药各类型细胞高温胁迫响应差异

6、高温作用下花粉壁合成基因染色质可及性的关闭导致花粉壁异常发育

进一步在单细胞水平上探究了高温条件下染色质可及性的动态变化，结果表明在高温条件下，不仅花粉壁合成的薄膜细胞的染色质可及性和基因表达都受到抑制（图6A，4A），而且花粉内壁基本消失，也缺乏完整的花粉柱和顶层盖（图6B-D），内膜在高温条件下基本消失（图6E）。表明花粉壁合成过程对高温极为敏感。

然后对高温下消失的绒毡层细胞进行了单细胞水平的基因共表达网络分析，发现了许多调控花粉壁形成的核心基因（如GhCYP703A2、MS188、QRT3、ACOS5等），其染色质开放性和基因表达在高温下都被明显抑制（图6I-H），从而导致高温下花粉壁合成异常。

图6 负责花粉壁合成的绒毡层细胞对HT最为敏感

7、QRT3和CYP703A2是在高温胁迫下棉花花药育性的关键正向调节因子

为了进一步验证上述结果，选择GhQRT3和GhCYP703A2进行分析，结果发现这两个基因的表达在高温下的绒毡层中被明显抑制（图7A,B），其敲除突变体在高温下均显示出明显的雄性不育表型（图7C,E）。另外，与野生型相比，cyp703a2无法形成正常的包含顶盖层和柱状层的花粉外壁外层（图7D），而qrt3花粉外壳没有刺，并且缺乏内壁（图7F）。这些结果表明，CYP703A2和QRT3对花粉壁合成具有正向调控作用。另外，分别对高温下花药进行了果胶/多聚半乳糖醛酸成分的免疫荧光和孢粉素的自发荧光检测(FISH)，结果发现高温下的果胶代谢过程和孢粉素合成过程均被扰乱（图7G-J）。

图7 QRT3和CYP703A2 为高温下棉花花药育性的关键正向调控因子

三、研究结论

在本研究中，首次构建了NT和HT条件下花药四分体阶段的单细胞转录组图谱和染色质可及性调查。描述了NT作用下花药中不同细胞类型的特异性表达和表观遗传谱，而且不同细胞类型对HT的反应也存在异质性。负责花粉壁形成的绒毡层细胞对HT最为敏感；在绒毡层细胞中专门表达的QRT3和CYP703A2是响应HT的核心因子。本研究结果不仅为植物花药发育的研究提供了大量的线索，也为今后耐热植物的改良提供了思路（图8）。