《Nature》评选的2025七大技术中，单细胞微生物分析技术引人注目。该技术能打开菌群的“基因黑匣子”，帮助科学家更好地理解复杂菌群的相互作用。微生物单细胞基因组，可在基因层面解析单个微生物的特征，而在转录组层面，微生态单细胞转录组测序技术亦极具意义，它可在单细胞水平解析微生物转录活动，精确捕捉微生物细胞内基因表达的动态变化，为研究微生物的功能、代谢、与环境互作等提供更精细的数据，推动微生物领域研究迈向新高度。
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近期发表于《Journal of Hazardous Materials》的研究“Proline mitigates antibiotic resistance evolution induced by ciprofloxacin at environmental concentrations”聚焦在抗生素耐药性这一全球关注的重大问题上。这项研究不仅发现脯氨酸能有效减缓抗生素耐药性发展，还借助微生物单细胞转录组测序（scRNA-seq）技术深入解析了其内在机制，为后续研究和实际应用开辟了新方向。
图1 脯氨酸延缓抗生素耐药性发生
研究背景：抗生素耐药性的环境挑战
抗生素耐药性（Antibiotic Resistance, AR）是全球公共卫生面临的重大挑战之一。环境中的细菌暴露于低浓度的抗生素（通常低于最小抑制浓度，sub-MIC）时，仍然能够生长并通过多种进化路径发展出多重耐药性。尽管在临床环境中已有一些控制抗生素耐药性进化的方法，但这些方法在环境中的应用却十分有限。因此，开发一种环境友好且长效的策略来限制抗生素耐药性的发展，成为了“One Health”框架下的迫切需求。
脯氨酸的发现：减缓耐药性进化的新希望
在这项研究中，研究人员筛选了18种氨基酸，发现Proline（脯氨酸）能够显著减缓土壤中分离的大肠杆菌（Escherichia coli）在环丙沙星压力下的耐药性进化。通过24天的进化实验，Proline将环丙沙星诱导的耐药性降低了50%以上。这一发现为控制环境中的抗生素耐药性提供了新的思路。
进一步实验表明，脯氨酸不仅对初始实验中的大肠杆菌有效，对已经具有环丙沙星耐药性的大肠杆菌克隆也能降低其耐药性。而且，脯氨酸对其他抗生素（如链霉素）诱导的耐药性也有缓解作用，这充分证明了脯氨酸在减缓细菌耐药性方面的广泛有效性。
图2 脯氨酸缓解环丙沙星暴露下大肠杆菌的耐药性进化
机制解析：Proline如何减缓耐药性进化？
为了揭示Proline减缓耐药性进化的机制，研究人员采用了多种技术手段，包括普通转录组学（bulk RNA-seq）、13C代谢通量分析以及微生物单细胞转录组测序技术（scRNA-seq）。
01、bulk转录组学分析：
通过RNA-seq，研究人员发现，Proline的添加显著下调了与三羧酸循环（TCA cycle）、氧化磷酸化和丙酮酸代谢相关的基因表达。另一方面，与核黄素代谢和精氨酸生物合成相关的基因表达上调。这表明脯氨酸可能通过调节这些基因的表达来影响细菌的代谢途径。
图3 脯氨酸缓解CIP抗性进化的差异表达基因及其机制
02、13C代谢通量分析：
进一步证实脯氨酸的添加显著降低了TCA循环的通量，减少了NADH的产生，进而降低了质子动力势（PMF）。由于PMF是驱动抗生素进入细菌细胞的重要能量，PMF的降低导致环丙沙星的摄取减少。同时，研究还通过实验测量了NADH、PMF和细胞内环丙沙星的浓度，结果均验证了上述机制。
图4 外源脯氨酸对TCA循环通量、NADH、PMF和细胞内环丙沙星浓度的影响
03、微生物单细胞转录组测序技术（scRNA-seq）分析：
通过scRNA-seq，研究人员发现，Proline的添加减少了环丙沙星耐药亚群的规模。具体而言，暴露于环丙沙星与脯氨酸的样本中cluster 3细胞比例显著升高，而cluster 4和cluster 6细胞比例降低。深入研究这些cluster中的基因表达情况后发现，cluster 4和cluster 6富含与脂肪酸生物合成、细菌运动性、DNA复制、毒力和细胞生长死亡等相关的高表达基因，这些基因通过外排泵、生物膜形成、抗生素靶标过表达、粘附和细胞分裂等机制使细菌产生耐药性。这一结果清晰地展示了脯氨酸能够减少环丙沙星耐药亚群的规模，从而有效抑制整体耐药性发展。
图5 scRNA-Seq分析揭示了CIP耐药性进化的种群内异质性
土壤微宇宙实验：Proline的环境应用潜力
为了验证Proline在真实环境中的效果，研究人员进行了土壤微宇宙实验。结果表明，Proline的添加不仅降低了土壤微生物群落的整体抗生素耐药性，还增加了群落的多样性和稳定性。特别是在中等剂量（5 mg/kg）下，Proline的效果最为显著。
这项研究表明，Proline作为一种“进化减缓剂”，在控制环境中的抗生素耐药性方面具有巨大的潜力。通过降低TCA循环通量和NADH的产生，Proline减少了细菌对抗生素的摄取，从而减缓了耐药性的进化。与纳米材料或其他化学物质相比，Proline具有高效、环境友好且成本低廉的优势，适用于多种抗生素污染的环境。
图6 添加脯氨酸降低土壤微生物的抗生素抗性
#微生物单细胞转录组测序技术的广泛应用#
文章中使用的微生物单细胞转录组数据来自MobiMcrobe微生物单细胞测序系列平台，MobiMicrobe scRNA-seq不仅在本研究中深入探究微生物耐药机制发挥了关键作用，还在多个研究领域展现了巨大的应用潜力。
未来，这种技术联用的方法可应用于更多环境微生物研究课题。例如，在研究不同污染物对微生物群落的影响时，通过scRNA-seq技术分析单个微生物细胞的响应，结合代谢通量分析等技术解析其代谢变化，从而深入了解污染物的生态毒理机制。在研究微生物群落的演替过程中，利用scRNA-seq技术跟踪不同微生物种群的动态变化，结合宏基因组学技术揭示群落结构和功能的改变，为生态修复和环境管理提供科学依据。
图7 墨卓生物MobiMicrobe scRNA-seq系列产品
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参考文献
Wang H, Wu X, Xu J, Lu Z, Hu B, Zhu L, Lu H. Proline mitigates antibiotic resistance evolution induced by ciprofloxacin at environmental concentrations. J Hazard Mater. 2025 Feb 10;489:137561.
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