RNA pull down实验技术介绍

RNA pull down实验技术介绍

一、技术概述

RNA pull down 实验是用于检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间互作的实验手段。该技术使用体外转录法标记生物素RNA探针, 与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过Western Blot 实验检测特定的 RNA结合蛋白是否与RNA相互作用，亦可通过质谱检测实验进行未知的互作蛋白鉴定。

二、实验目的

本实验技术无论是探索非编码RNA的分子机制，还是开发靶向RNA-蛋白网络的药物，均能提供关键数据支持，推动基础研究与转化医学的进展。

三、实验流程
(一）探针准备

1、PCR扩增目的片段

      表2  PCR反应条件

温度（℃）	时间（s）	循环数
98	10	31
55	5
72	10

表3  PCR反应体系

试剂	使用量(μl)	终浓度
PrimeSTAR Max Premix（2X）	25 μl	1X
Primer F	1μl	0.2 μM
Primer R	1μl	0.2 μM
Template	10ng
灭菌水	Up to 50 μl

全长基因片段的获取，纯化、回收(DNA回收试剂盒，天根：DP214-02 ) ，以全长片段为模板用sense-F/sense-R和AntiSense-F/AntiSense-R引物PCR扩增获

取正义链和反义链的目的基因，跑1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，90V，30min。

2、胶回收

1. 柱平衡：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500µl平衡液BL，        

 12,000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。

1. 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净EP管中，称取重量。
2. 向胶块中加入等体积的溶液PC，50℃水浴放置10min左右，使胶块充分 溶解。
3.  将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中，12,000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
4. 向吸附柱中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
5. 重复操作步骤
6. 将吸附柱CB2放入收集管中，12,000rpm离心2min，将吸附柱置于室温，放置3min。8、将吸附柱CB2放入一个新的离心管中，向吸附膜中间位置滴加30μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心1min，收集DNA溶液。

（二）RNA pull down实验

1、体外转录&生物素标记RNA

1. 取一支无RNA酶的EP管，加入表2-2的转录体系，37℃孵育35min。

表2-2 转录体系

线性化DNA片段	1ug
Biotin RNA Labeling mix	2µl
10×Transcription buffer	2µl
RNA Polymerase	2µl
补足RNase-free水至20µl

1. 取出孵育好的EP管，加入2µl的DNaseⅠ，37℃孵育15min，除去DNA。
2. 取出上述操作的EP管，加入2µl 0.2M EDTA（pH=8.0）终止反应。
3. 取3µg Biotin标记的RNA，加入适量Structure Buffer（10mM Tris pH=7.0，0.1M

KCl，10mM MgCl2），使得RNA形成二级结构。然后将RNA 95℃加热2min，冰浴3min，室温静置30min。

2、链霉素亲和磁珠与生物素标记的RNA结合

1. 颠倒混匀磁珠，并转移30ul磁珠到一个新的EP管中将EP管置于磁力架上静置约1min，进行磁性分离；
2. 吸除上清，并加入60ul A液重悬磁珠，然后进行磁性分离；
3. 吸除上清，并加入30ul B液重悬磁珠，然后进行磁性分离;
4. 吸除上清，并加入30ul C液重悬磁珠，然后进行磁性分离;
5. 重复步骤5；
6. 吸除上清，并加入30ul 1X RNA Capture Buffer重悬磁珠;
7. 加入50pmol 生物素标记的磁珠，并吹打混匀；
8. 室温旋转孵育30min

3、样本前处理

1. 用1ml 4℃的RLN 悬浮细胞,冰上孵育５min;
2. 1450 ×g, 4 ℃ 离心２min，去上清；
3. 用100ul预冷的RLN洗涤１次（不能悬浮沉淀）；
4. 用100ul预冷的protein lysis buffer重新悬浮细胞（超声2s停4s；10次）；然后涡旋30s，并吹打混匀；
5. 冰上孵育30min；
6. 17000×g, 4℃，离心15min；
7. 转移上清到一个新的EP管备用。

4、磁珠复合物与蛋白结合

1. 把预处理好的磁珠，放置到磁力架上进行磁性分离；
2. 吸除上清，并加入30ul C液重悬磁珠，然后进行磁性分离;
3. 重复步骤2；
4. 吸除上清，加入100µL of 1X Protein-RNA Binding Buffer 重悬磁珠；
5. 把样本放置到磁力架上进行磁性分离；
6. 吸除上清，并加入100ul 按下表配制的反应体系的mix重悬磁珠：
7. 4℃旋转孵育30min；

序号	试剂	体积（ul）
1	10X Protein-RNA Binding Buffer	10
2	50% glycerol	30
3	细胞裂解液	30
4	Nuclease-free water	30

5、洗涤与洗脱

1. 把样本放置到磁力架上进行磁性分离；
2. 吸除上清，加入100µL 1X wash buffer重悬磁珠；
3. 重复步骤1与2两次；
4. 把样本放置到磁力架上进行磁性分离；
5. 吸除上清，加入50ul Elution buffer,重悬磁珠；
6. 把样本放置到磁力架上进行磁性分离；
7. 转移上清到新的EP管中，即为pull down 产物；
8. 向 pull down产物中加入13ul loading buffer,并于沸水中水浴10min
9. 产物进行后续质谱检测

• 技术优势

✅ 高特异性

✅ 广泛适用性

✅ 高灵敏度

✅ 多维度分析  

• 适用范围

1️⃣ 非编码RNA功能研究  

2️⃣ 疾病机制探索

3️⃣ 病毒-宿主互作解析

4️⃣ 药物开发与筛选  

六、代表性实验结果