RNA结合蛋白研究技术：RIP-seq实验分析流程及案例分享

RNA免疫共沉淀—RIP-seq（RNA Immunoprecipititation）是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，RIP利用目标蛋白的抗体将相应的RNA-蛋白复合物（RBP）沉淀下来，分离纯化捕获的RNA，结合高通量测序技术对目标RNA进行测序分析。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，蛋白结合对象为RNA，RIP-seq即对富集得到的RNA片段进行高通量测序，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能够有效探究在基因组范围内发现与蛋白或蛋白复合物相结合的RNA。

01 应用方向：

1. 研究细胞内RNA与蛋白结合情况

2. 发现RBP与非编码RNA（LncRNA、miRNA等）的相互作用

3. 绘制全基因组范围的RNA与RBP相互作用图谱

02 实验流程：

1.前期准备

· 需要提供成熟的基因组信息（包括基因组fa文件、gff 文件、pep.fa 文件）。

· 需要提供抗体（对应的WB检测图，若无法提供，可委托爱基百客进行WB检测）。

· 样本：动物组织、植物组织、肿瘤组织、细胞、真菌样品均可以。

· 对照：一般选用Input作为阳性对照；此外，可以设置样本对照（例如，处理前vs处理后）。

· 抗体！抗体！抗体！：首选ChIP级别抗体，至少IP级别；若没有IP级别抗体，也可选择标签抗体（要确保标签和蛋白成功融合表达）。

2.具体步骤

主要步骤包括紫外交联、准备裂解产物、准备免疫沉淀的磁珠、免疫沉淀 RNA连接的蛋白-RNA 复合物、文库构建、上机测序、生信分析等。具体流程如下图所示：

研究对象RNA主要包括mRNA、LncRNA、circRNA、miRNA，针对不同种类RNA选择不同的建库方式，其中mRNA、LncRNA、circRNA一般选择去除rRNA后构建链特异性文库，miRNA一般构建Small RNA文库。

链特异性文库构建流程如下图所示：

 链特异性文库实验步骤

链特异性文库：可以保留转录组测序时转录本的方向信息，即可以确定转录本是来源于基因组的正链或负链。

Small RNA文库构建流程如下图所示：

 Small RNA文库实验步骤

03分析流程

分析结果主要包括基因组比对分析、Reads在基因功能元件上分布、PCA分析、基因组Peak分析、Peak关联基因的GO/KEGG分析、富集区间Motif分析等。（感兴趣的老师可以联系爱基百客相关人员获取结题报告demo）

04多组学联合分析和案例分享

在研究中大多数技术都不是单一使用，RIP-seq也不例外，它会搭配其他组学一起对研究的深度和广度进行扩充。RIP-seq可以与多种技术联合分析，例如RNA-seq、 RNA pull down、m6A-seq等。本次精选几篇联合分析的文章，帮助大家开拓思路。

案例分享一

题目：RIP-Seq of EZH2 Identifies TCONS-00036665 as a Regulator of Myogenesis in Pigs E2H2的RIP-seq将TCONS-OOO36665鉴定为猪肌细胞生成的关键因子

发表单位：华中农业大学

期刊：Frontiers in Cell and Developmental Biology（IF2022=6.081）

相关技术：RIP-seq、RNA pull down、lncRNA-seq、ChIP-seq等（爱基都可提供）

研究内容：EZH2是PCR2的催化亚基，它包含一个SET结构域，可催化赖氨酸 27 (H3K27me3) 上的组蛋白H3三甲基化以产生表观遗传沉默标记。EZH2通过与转录因子或RNA转录本相互作用来实现其功能。在本研究中，作者采用RIP-seq和lncRNA-seq来鉴定EZH2结合的lncRNAs，通过生物信息学分析鉴定出356 个可以结合EZH2的lncRNA，并对其中的TCONS-00036665进行了表征。

TCONS-00036665能促进猪骨骼肌卫星细胞增殖但抑制细胞分化，这种功能在猪和小鼠之间是保守的。进一步的机制研究表明，TCONS-00036665可以与EZH2结合，并将EZH2招募到靶基因 p21、MyoG和Myh4的启动子上，从而富集H3K27me3以及抑制靶基因表达和猪肌细胞生成。

总之，lncRNA TCONS-00036665通过与 EZH2的相互作用调节猪肌细胞的生成。

 结合EZH2的LncRNA鉴定

案例分享二

题目：The m6A reader MhYTP2 regulates MdMLO19 mRNA stability and antioxidant genes translation efficiency conferring powdery mildew resistance in apple

m6A阅读蛋白MhYTP2调节MdMLO19 mRNA稳定性和抗氧化基因翻译效率，从而赋予苹果白粉病抗性

发表单位：西北农林科技大学园艺学院

期刊：Plant Biotechnology Journal（IF2022=13.263）

相关技术：RIP-seq、EMSA、m6A-seq、RNA-seq等（爱基都可提供）

研究内容：

研究人员前期获得了RNA结合蛋白MhYTP2超表达转基因苹果植株，并发现转基因植株具有明显的白粉病抗性。作者首先证明了苹果的MhYTP2同样具有m6A结合功能；其次，通过检测转基因材料中m6A甲基化酶和去甲基化酶相关基因的表达水平，发现MhYTP2的超表达会改变m6A甲基化酶和去甲基化酶相关基因的表达。

借助于m6A-seq、RNA-seq和Ribo-seq等技术，研究人员发现MhYTP2过表达增加了一批mRNA的m6A修饰水平和翻译效率。同时，外显子区域的m6A修饰水平可能与mRNA的稳定性呈负相关，而非翻译区（UTR）的m6A变化与相关mRNA丰度呈正相关。此外，MhYTP2能够与含m6A修饰白粉病感病基因MdMLO19和MdMLO19-X1的mRNAs结合，并加速其降解；MhYTP2还能够结合谷氨酸脱氢酶1基因MdGDH1L的mRNA，并提高其翻译效率，增加蛋白积累，提高转基因植株的抗氧化能力。

综上所述，该研究结果揭示了苹果m6A基因谱、MhYTP2对m6A基因谱的影响以及m6A在调控苹果白粉病感病基因MdMLO19 mRNA稳定性和抗氧化相关基因翻译效率中的作用。

 m6A阅读蛋白调控苹果白粉病抗性分子机制

总 结

本期主要为大家介绍了RIP-seq的技术原理、应用方向、实验流程、案例分享，那么做完RIP-seq之后该如何解读报告呢？这部分内容后期再为大家详细介绍，敬请期待。