MSP 检测实验技术介绍

MSP 检测实验技术介绍

一、技术概述

单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）是基因组中单个碱基的变异，在人类基因组中广泛存在，与疾病易感性、药物反应及个体化医疗等密切相关。通过特异性探针或深度测序精准识别SNP位点，提供基因分型、等位基因频率及功能预测分析，助力遗传机制研究与临床转化应用。

二、实验目的

通过检测样本中目标SNP位点的基因型（如AA、AG、GG），分析其与表型（疾病、药物疗效、性状等）的关联性，为疾病研究、个体化用药等领域提供数据支持。  

三、实验流程
1、DNA抽提

a. 将样品管离心，10,000 rpm(~11,200xg)离心1 min,，弃上清，留下沉淀。

b. 加入200uL的缓冲液GA，之后，严格按照“TIANamp Genomic DNA Kit”说明书步骤，按细胞的样本类型进行提取DNA，详见说明书附件。

c. 最终洗脱体积：50 uL

2、亚硫酸氢盐转化

a. 配制亚硫酸氢盐转化体系:取20 uL 基因组 DNA，加入130 uL CT Conversion Reagent，使用移液器轻轻吹打混匀；

b. 将反应体系转移至热循环仪中，98℃孵育 10 min，64℃孵育 2.5 h；

c. 反应结束后短暂离心，收集管壁溶液于管底，将反应液转移至 1.5 mL 离心管中；

d. 柱平衡：将 DNA Spin Column 置于 Collection Tube，向吸附柱中加入 500 uL Buffer BL，12,000 rpm离心 1 min，去除 Collection Tube 中的废液，将 DNA Spin Column 重新放回 Collection Tube 中；

e. 加入 600 μL Buffer GB，使用移液器吹打混匀；

f. 将上一步所得溶液转移到 DNA Spin Column 中 12,000 rpm 离心 1 min，弃掉 Collection Tube 中液体，将 DNA Spin Column 放入 Collection Tube 中；

g. 加入 600 uL Buffer PW12,000 rpm 离心 1 min，弃掉Collection Tube 中液体，将 DNA Spin Column 放入 Collection Tube 中；

h. 加入 600 uL Buffer DB，室温放置 15 min，12,000 rpm离心 1 min 弃掉 Collection Tube 中液体，将 DNA Spin Column 放入 Collection Tube 中；

i. 加入 600 uL Buffer PW，12,000 rpm 离心 1 min，弃掉 Collection Tube 中液体，将 DNA Spin Column 放入 Collection Tube中；

j. 重复步骤 9；

k. 12,000 rpm 离心 2 min，将 DNA Spin Column 放入一新的的 1.5 mL 离心管中；

l. 将 DNA Spin Column 管盖打开，室温放置 5 min，使乙醇完全挥发；

m. 向 DNA Spin Column 中加入 20 uL Nuclease-free Water，室温静置 2 min；

n. 12,000 rpm 离心 2 min 即得到转化后 DNA。

3、PCR扩增

1）将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。

2）冰上配制下表中的反应液

成分	加入量	终浓度
TaKaRa EpiTaq HS（5 U/μl）	0.25 μl	1.25 U/50 μl
10 × EpiTaq PCR Buffer (Mg2+ free)	5 μl
25 mM MgCl2	5 μl
dNTP Mixture（各 2.5 mM）	6 μl
Forward Primer (10μM)	1μL	0.2 μM
Reverse Primer (10μM)	1μL	0.2 μM
DNA	2μL
RNase-free Water	To 50μL

3）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

4）采用三步法程序进行反应：

循环数	步骤	温度	时间
40	预变性	98℃	10s
	退火	55℃	30s
	延伸	72℃	30s

4、产物电泳

产物上样量：4uL

电泳条件为：120V电压，200mA电流，电泳时间30min.

• 技术优势

✅ 高特异性：双引物设计严格区分甲基化与非甲基化DNA，避免假阳性

✅ 高灵敏度：可检测低至1%甲基化水平的DNA  

✅ 广泛适用：支持多种样本类型（血液、组织、FFPE等）  

✅ 结果直观：凝胶电泳直接显示甲基化状态，便于快速判读  

• 适用范围

1️⃣ 肿瘤研究：抑癌基因（如p16、BRCA1）启动子甲基化检测

2️⃣ 疾病诊断：结直肠癌、肺癌等甲基化标志物筛查

3️⃣ 发育生物学：如胚胎发育中表观遗传调控机制解析

4️⃣ 环境毒理学：化学暴露对DNA甲基化影响的评估  

5️⃣ 药物研发：去甲基化药物（如5-氮杂胞苷）疗效监测

六、代表性实验结果

   MSP_琼脂糖凝胶电泳图