研究前沿| Nature：艰难梭菌引发肠道神经源性炎症的新机制

前言

     艰难梭菌感染（Clostridioides difficile infection）是目前发达国家医院和社区内获得性肠道细菌感染腹泻的最主要原因之一。在美国，每年有约50万例病例和导致约29,000例死亡。艰难梭菌（C. difficile）是一种产生孢子的机会性病原体，在正常的肠道菌群被破坏时可以感染人类结肠，引发腹泻和腹痛，严重情况下可导致假膜性结肠炎和毒性巨结肠。艰难梭菌主要通过两种同源蛋白毒素，即毒素TcdA和TcdB的作用来引发疾病。这些毒素可以引发过度炎症反应，从而损害结肠组织并促进C. difficile在肠道的增殖，但这些毒素是如何引起炎症反应的致病机理一直以来是个谜团。
    2023年9月13日，哈佛大学医学院和波士顿儿童医院董民教授实验室领头的合作团队在Nature上在线发表了文章：“C. difficile intoxicates neurons and pericytes to drive neurogenic inflammation”，首次以全新的视角揭示了TcdB毒素作用于肠道内的感觉神经元 （sensory neuron）和血管周边细胞（pericyte），从而诱发严重的神经源性炎症反应。

主要研究方法及成果

1）通过对近几年发布的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据的分析发现 FZD1/2/7 在小鼠和人类结肠的感觉神经元中有高表达， 而 CSPG4则高度富集在血管周边细胞(pericytes)，揭示了毒素有可能优先攻击肠道神经元和pericytes。研究证实了感觉神经元和pericytes 都对毒素高度敏感， 而且毒素在极低浓度下就可以诱导感觉神经元分泌神经肽，也可以导致pericyte释放细胞因子和引起细胞形变。

2）为了评估TcdB在小鼠模型体内是否引发与神经源性炎症，研究人员将TcdB直接注入野生型小鼠的盲肠腔，结果表明，TcdB可以迅速导致盲肠组织中SP和CGRP水平的上升。但是当注射TcdB到SP基因敲除小鼠（比如Tac1-/-）或者CGRP基因敲除小鼠（Calcb-/-）中时，基因敲除小鼠的组织病理学评分明显低于野生型小鼠。在感染模型中，野生型小鼠感染C. difficile菌株时出现了严重的病理学症状， 但是SP或CGRP基因敲除小鼠却显示较轻微的病理学症状。

3）为了确定感觉神经元的中心作用，董民团队开发了新的实验方法 （命名为“毒素遗传学方法，toxogenetics）（图1）。这个方法利用突变去除毒性的白喉毒素作为一个载体，可以特异性的把融合的蛋白递送到特定的表达白喉毒素受体的小鼠细胞中。白喉毒素不能结合小鼠自身的受体蛋白，但可以通过一系列遗传操作来特异的表达外源的白喉毒素受体到特定细胞中。通过这一新方法，可以实现只递送TcdB 毒素的酶活功能域到感觉神经元里，结果小鼠很快出现腹泻，在结肠组织中出现了严重的水肿以及轻度的中性粒细胞浸润和上皮细胞破坏。 

图1 毒素遗传学方法（toxogenetics） 

4）用TcdB进行的盲肠注射试验和使用艰难梭菌630Δerm的CDI小鼠模型中，施用阿匹瑞坦、奥西泮或氟曼珠单抗降低了组织病理学评分。在患有CDI的小鼠中，阿匹瑞坦和奥西泮都降低了第二天的病原体负荷 感染后。药物均未影响艰难梭菌的体外生长速率，也未分别对Tac1小鼠或Calcb KO小鼠产生影响，这表明CDI中病原体定植减少并非由于对艰难梭菌的直接影响。

5）将TcdB2注射到小鼠脚垫中诱导水肿，这可以通过阿瑞匹坦或奥西泮预防，这表明TcdB2也诱导神经源性炎症。该作用独立于CSPG4，因为TcdB2在CSPG4 KO小鼠中诱导脚垫水肿。此外，在脚垫注射试验中，TcdA也诱导水肿，这被阿瑞匹坦阻断。与单药治疗相比，阿普匹他和奥司琼或阿普匹特和氟曼珠单抗的联合治疗没有显示出相加作用。

6）FDA批准的药物，比如SP信号阻断剂aprepitant、CGRP受体拮抗剂和结合CGRP的单克隆抗体，可以在小鼠模型上显著减轻C. difficile 感染的病理症状。这些药物已在其他临床情境中证明是安全有效的，这为未来进行的临床试验提供了很大的前景。