DAP-seq文章 | DAP-seq技术在R2R3-MYB转录因子LmMYB15调控金银花绿原酸生物合成和苯丙素代谢的分子机制研究中的应用

绿原酸(CGA)是灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides，别称：金银花)最重要的活性药物成分，在医学领域对天然CGA的需求急剧增长。虽然CGA生物合成的关键基因已有报道，但其转录调控机制在很大程度上仍然是未知的。因此，研究CGA生物合成的分子调控机制对于利用基因工程技术培育高CGA含量的金银花新品种具有重要意义。

2021年4月29日，重庆文理学院园林与生命科学学院陈泽雄教授的研究成果，发表在植物科学领域的知名学术期刊Plant Science上，文章题目为“A R2R3-MYB transcriptional activator LmMYB15 regulates chlorogenic acid biosynthesis and phenylpropanoid metabolism in Lonicera macranthoides”，该期刊的影响因子为5.363。该研究使用DNA亲和纯化测序(DAP-seq) 技术鉴定了金银花R2R3-MYB转录因子LmMYB15的DNA结合基序及其靶基因。进一步研究揭示了LmMYB15调控金银花CGA生物合成和苯丙素代谢的分子机制，该研究成果为利用基因工程策略开发富含CGA的金银花新品种提供了宝贵的基因资源。

该研究首先通过对金银花不同发育时期的不同组织进行质谱检测和转录图谱分析，发现LmMYB3、LmMYB4、LmMYB15和LmMYB31基因与CGA的含量存在显著的相关性，表明这些基因在调控CGA生物合成中发挥潜在作用。LmMYB15和其他MYBs蛋白质的系统发育树分析结果表明，LmMYB15与红花CtMYB1、拟南芥AtMYB15和AtMYB14、番茄SlMYB15和菊花CmMYB15具有相近的同源性。酵母双杂交试验表明LmMYB15可作为转录激活因子。在烟草中过表达LmMYB15基因，促使CGA的含量显著增加，表明LmMYB15是CGA生物合成的正调控因子。

图1. DAP-seq分析鉴定全基因组范围的LmMYB15靶基因
(A) LmMYB15结合的peaks在基因组上的分布分析。(B) 通过MEME-Chip分析筛选LmMYB15的DNA结合基序，其中(C/T) (C/T) (C/T) ACCTA(C/A) (C/T) (A/T) (即YYYACCTAMYW) 和 (C/T)ACCTA(C/A)(即YACCTAM)为最集中富集的2个基序。

为了阐明LmMYB15的分子机制，采用DAP-seq技术鉴定了LmMYB15的DNA结合基序及其直接的下游靶基因，包括4CL、MYB3、MYB4、KNAT6/7、IAA26和ETR2等。酵母单杂交和双荧光素酶报告基因实验证实，LmMYB15可以结合4CL、MYB3和MYB4的启动子，并激活这些基因的表达，从而促进CGA的生物合成和苯丙素代谢。该研究揭示了一种LmMYB15调控金银花CGA生物合成的新的分子机制，同时为高CGA含量的金银花育种策略提供了新途径，这对于提高金银花的药用性能具有重要意义。

图2. LmMYB15正向调控CGA生物合成的分子机制模式图

总结：该研究从金银花中分离到一个R2R3 MYB转录因子LmMYB15，它是CGA生物合成的正调控因子，它直接与下游靶基因的启动子结合，包括4CL、MYB3和MYB4，从而促进CGA的积累和苯丙素代谢。该研究为CGA生物合成的转录调控机制提供了新见解，同时为培育具有更高药用价值的高CGA含量金银花新品种提供了新的策略。