RNA-seq——四、根据序列比对结果筛选差异基因


写在前面——经过前面的一系列分析,我们得到了几个counts数据,接下来就需要根据这些数据来进行分析。本文使用Rstudio,从序列比对结果中筛选出差异基因,目的是(根据不同基因的表达量)找出实验组与对照组的差异。

本文使用的数据见RNA-seq——上游分析练习(数据下载+hisat2+samtools+htseq-count)
参考:
RNA-seq(6): reads计数,合并矩阵并进行注释
RNA-seq(7): DEseq2筛选差异表达基因并注释(bioMart)

1. 合并矩阵并进行注释

rm(list = ls())
options(stringsAsFactors = FALSE)

# 读取数据
control_1 <- read.table("SRR3589959.count", col.names = c("gene_id", "control_1"))
control_2 <- read.table("SRR3589961.count", col.names = c("gene_id", "control_2"))
treat_1 <- read.table("SRR3589960.count", col.names = c("gene_id", "treat_1"))
treat_2 <- read.table("SRR3589962.count", col.names = c("gene_id", "treat_2"))

# 将数据合并
raw_count <- merge(merge(control_1
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当然!下面是一个简单的 bulk RNA-seq 教程,帮助您了解如何进行 bulk RNA-seq 实验和分析。 步骤1:实验设计 - 确定您的研究目的和问题。 - 选择适当的生物样本和处理组。 - 设计实验,包括处理组和对照组,并考虑技术重复。 步骤2:样本准备和RNA提取 - 从每个样本中收集细胞或组织。 - 使用RNA提取试剂盒从细胞或组织中提取总RNA。 - 在提取过程中,确保避免RNA降解。 步骤3:文库制备 - 使用RNA-seq试剂盒对总RNA进行磷酸化、逆转录和扩增。 - 为了减少批次效应,可以使用技术重复。 步骤4:高通量测序 - 将文库加载到Illumina或其他高通量测序平台上。 - 运行测序,生成原始测序数据。 步骤5:质量控制和数据预处理 - 对原始测序数据进行质量控制,包括去除低质量读取和去除接头序列。 - 使用软件(如FastQC)评估数据质量,并根据需要进行修剪或过滤。 步骤6:基因表达分析 - 将修剪后的测序数据与参考基因组比对。 - 使用软件(如HISAT2或STAR)进行比对,并生成比对文件(如BAM格式)。 - 使用软件(如HTSeq或featureCounts)计算基因的表达值。 步骤7:差异表达分析 - 使用统计学方法(如DESeq2或edgeR)来识别在处理组和对照组之间差异表达的基因。 - 设置合适的阈值来确定差异表达基因。 - 对差异表达基因进行进一步的功能注释和通路分析。 步骤8:结果解释和验证 - 从差异表达基因列表中选择感兴趣的基因进行验证。 - 使用定量PCR、免疫印迹等技术验证RNA-seq结果。 这只是一个 bulk RNA-seq 教程的概述,每个步骤都还有很多具体细节和方法可以选择。希望这对您有所帮助!如果您有任何进一步的问题,请随时提问。

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