做外显子捕获测序实验时,会用到Cot DNA,blocker(封闭接头序列),探针(DNA/RNA均可),链霉素磁珠等,它们具体起什么作用呢?下面,我们就来聊聊这个问题。
就实验原理来讲,外显子捕获测序的基本流程是:1.先对各个样品独立构建常规测序文库;2:等摩尔比例混合各个待杂交的文库;3:在杂交缓冲液体系内加入文库、杂交探针、Cot DNA、Blocker等;4.加入链霉素磁珠抓取杂交复合状态DNA;5:在洗脱缓冲液中洗脱目标文库,并扩增。
下图是正常建好的文库示意图。
大家都知道,DNA是双链互补配对的。当加热打开DNA双链变性为单链DNA之后,慢慢降低温度,单链DNA会根据互补配对原则自然还原回双链状态(也就是退火过程)。那么,可以想象一下,当很多不同的DNA文库混合在一起的时候,进行退火操作,可能会产生什么样子的DNA结合状态呢?下图说明了其中可能存在的3种情况。
由上图可知,不论哪种状态,都不可能捕获到目标DNA。其实,情况2、3的杂交状中,P5或者P7端还可以杂交第三个、第四个等等分子。
所以,加入Blocker就是为了阻止P5、P7端的杂交,从而阻止非特异性杂交。Cot DNA则是为了阻止原来互补配对的单链杂交回来。带Biotin修饰的探针是为了杂交靶序列,链霉素磁珠是为了吸附Biotin修饰的杂交复合物。