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表观基因组分析


大规模并行测序技术为表观基因组学领域奠定了基础。本文描绘了用于表观基因组分析的关键方法,包括(1)亚硫酸盐测序,(2)染色质免疫沉淀测序(ChIP-Seq),(3)测定开放染色质,和(4)基因组3D构象捕获。

亚硫酸盐测序

全基因组DNA甲基化可以通过基于抗体富集的方法和亚硫酸盐转化的DNA测序实现。基于富集的方法可以定性检测甲基化修饰区域,能够区分5mC5hmC,并且可以与结合酶切提高分辨率和敏感性。基于抗体富集的方法需要每个样品测序50-100 M 短序列。

亚硫酸盐处理的DNA直接测序可以定量DNA甲基化修饰水平,但不能区分5mC5hmC。亚硫酸盐测序有两个主要的文库构建的策略。在第一种方法(示出)中,加入连接子的基因组文库进行亚硫酸盐处理(Lister等人,2009)。在第二种中(未显示),基因组DNA首先进行亚硫酸盐转化,然后进行文库构建(Miura等,2012)。对于转换方法,为每个样品产生10亿个100nt序列读数,并且文库构建方法在基因组覆盖中引入不同的文库偏好。

  1. DNA甲基化分析
    胞嘧啶修饰是哺乳动物基因组的一个特点。

全基因组水平的5-甲基-胞嘧啶修饰(5mC,又称DNA甲基化)及其氧化衍生物(例如5hmC)图谱绘制通常使用基于富集和转化的方法结合大规模并行测序来实现。亚硫酸盐处理可以定量5mC修饰图谱,但不能区分5hmC。抗体富集可以对5mC和5hmC进行定性测量。将亚硫酸盐转化或抗体富集的DNA纯化,进行文库构建并克隆测序。后期需要特定的算法和工具进行序列比对和甲基化水平计算。

  1. 染色质免疫沉淀测序
    组蛋白化学修饰。

全基因组水平的组蛋白修饰通常使用染色质免疫沉淀偶联大规模并行测序(ChIP-seq)来实现。 组蛋白结合的DNA可以通过超声处理、酶消化或转座子插入的方式(未显示)从基因组中释放。如果使用超声处理,染色质必须首先进行化学交联(见步骤4)。组蛋白解离后,特定的化学修饰通过免疫结合富集。富集后的复合体进行DNA纯化,文库构建,大规模测序,并进行生信分析。
3. 开放染色质分析
核小体耗尽的区域富含调节元件。
全基因组水平的开放染色质分析通常通过DNA片段集合的大规模并行测序实现,此片段集合可从经转座子插入、酶促消化或超声处理的完整染色质中释放得到。选取所得DNA片段大小或苯酚-氯仿提取之,以耗尽核小体结合的DNA。富集后的复合体进行DNA纯化,文库构建,大规模测序,并进行生信分析。

  1. 3D染色质捕获
    染色质环接触揭示远端调控元件和结构域。
    全基因组水平的长范围染色质接触是通过邻近连接产生的DNA片段集合的大量并行测序实现的。完整的染色质以物理连接与三维空间相邻的基因组远端核小体相交联。

交联的染色质被酶促消化,所得的DNA用生物素标记末端并进行邻近连接。连接的DNA通过超声处理或酶消化被剪切,而连接点通过链霉亲和素下拉富集。纯化得到的DNA,进行文库构建、大规模测序及生信分析。

SnapShot:Epigenomic Assays

染色质免疫沉淀测序
全基因组水平的组蛋白修饰通过ChIP-seq检测到了(Barski等,2007)。通常,对25-50万个免疫沉淀片段进行组蛋白标记的测序。显示了从与100-300bp基因组片段相关的染色质释放核小体的两种主要策略。此外,利用基于转座子的染色质片段的策略近来已经适用(Schmidl等,2015)。
绘制开放的染色质
开放染色质区域的基因组位置通过直接测序从经转座子插入(Buenrostro等,2013)或酶消化(Boyle等,2008; Crawford等,2006)的染色质中释放的基因组DNA片段来测量。该方案的变体(未显示)化学性交联染色质并使用超声处理随后释放通过苯酚 - 氯仿萃取富集的非交联区域(Boyle等人,2008)。测序要求取决于实验参数和分辨率要求,范围为从每个样品10到100多百万个片段。
染色体构象捕获
染色体构象捕获(3C)技术提供了DNA片段在三维(3D)空间的基础上相互作用的位置(Bonev和Cavalli,2016)。为了测量全基因组水平的染色质相互作用,单个实验通常需要5亿个序列读数。

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