单细胞RNA和单细胞ATAC文库理解

ATAC-seq

ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing）是利用转座酶研究染色质可及性的高通量测序技术。

染色质可及性

首先介绍一下什么是染色质可及性。正常情况下，DNA与核小体缠绕折叠在一起形成染色质，但是DNA的复制、转录都需要将染色体的高级结构解开，然而解开并不需要打开全部染色体，只需要打开表达基因的区域，这部分打开的染色质，就叫开放染色质（open chromatin）。而染色质一旦打开，就允许一些调控蛋白（比如转录因子和辅因子）跑过来与之相结合。而染色质的这种特性，就叫做染色质的可及性（chromatin accessibility）。

ATAC-seq原理

DNA转座，是一种把DNA序列从染色体的一个区域搬运到另外一个区域的现象，由DNA转座酶来实现。这种转座插入DNA，需要插入位点的染色质是开放的，因此，如下图A，我们只要人为地将携带已知DNA序列标签的转座复合物（即带着红色蓝色测序标签的转座酶Tn5）加入到细胞核中，这样他就会插入到开放的染色质区域，再利用已知序列的标签进行PCR后测序，就知道哪些区域是开放染色质了，这也就是ATAC-seq的原理。最后得到的DNA片段，包括了开放区域的剪切片段，也包括了横跨一个或多个核小体的长片段。

根据片段长度，可以将片段分为分为Fragments in nucleosome-free regions(<147 base pairs)（不包含核小体的片段）、Fragments flanking a single nucleosome (147~294 base pairs)（包含一个核小体的片段）, 以及更长的多核片段。片段长度分布如下图，不包含核小体的片段最多，其次是单核片段，依次递减。

ATAC-seq出来的结果，和传统方法出来的结果具有很强的一致性，同时也和基于组蛋白修饰marker的ChIP-seq有较高的吻合程度。也就是说，ATAC-seq中的peak，往往是启动子、增强子序列，以及一些反式调控因子结合的位点。

scATAC-seq和scRNA-seq建库原理

ATAC-seq是把所有实验细胞看作了一个整体，获得所有细胞混合的基因信息。scATAC-seq是在ATAC-seq的基础上，进行细胞核的分选和标记通过barcode识别细胞核，解决了不同细胞群体的异质性的问题，能够检测出混杂样品测序所无法得到的异质性信息。

以10x 建库方法为例，比较scATAC-seq 和scRNA-seq建库方法的异同
二者都用胶珠（GEMs）的方法，不一样的是ATAC胶珠上的序列中不用UMI，因为基因组只有一对序列，无需像RNA一样定量。另外序列末端用接头引物Read 1N代替PolyT。

scRNA-seq通过结合cDNA的PolyA尾进行扩增，而scATAC-seq的DNA片段没有PolyA尾，取而代之的是Tn5酶转座剪切时插入的adaptors片段，可以与胶珠上的Read 1N序列互补。

DNA片段接上胶珠后，在另一端加Read2和Sample index序列。在此之前，scRNA-seq需要将cDNA酶切至合适的片段长度，而scATAC-seq的片段不进行打碎，接上Sample index和P7序列后进行扩增。

最后上机测序。V2版本scRNAseq如果是3‘单端测序，Read2读取最近的100bp读长，而Read1只读取16bp的细胞barcode序列和10bp的UMI序列，共26bp。V3是16+12=28bp。scATAC-seq则用双末端测序，读长一般不低于45bp。

scATAC-seq最后可以得到4个原始文件：

其中I1、I2分别是barcode和sample index，R1、R2是目的片段的双末端。