GSVA：pathway级别的差异分析

GSVA其实就是pathway级别的差异分析

标准差异分析通常是不够的，定位到成百上千个有统计学显著变化的差异表达基因后，同样是有成百上千个生物学功能注释（GO功能和KEGG通路），普通的超几何分布检验已经不能满足大家多元化的分析了，所以就有了大家耳熟能详的GSEA分析，以及绝大部分人比较陌生的GSVA分析。

GSVA分析的文章发表于2013年，GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-Seq data 同样是broad 研究生出品，其在2005年PNAS发表的gsea已经高达1.4万的引用了，不过这个GSVA才不到300。

一般人做数据挖掘，到差异基因的生物学功能注释（GO功能和KEGG通路）就结束了，进而也就是去使用一些网页工具，比如string，出一些花花绿绿的图表，比如PPI网络图。实际上，使用了GSVA，可以把成百上千个生物学功能注释（GO功能和KEGG通路）转换为新的表达矩阵，就是具体的每个通路在各个样本的基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis，GSVA）值，我们把它当作一般的矩阵文件，进行差异表达分析，热图绘制，火山图绘制。

下面我们以文献 **Metabolic remodeling contributes towards an immune‐suppressive phenotype in glioblastoma **为例，欣赏它的两个图表，文章发表在Cancer Immunology, Immunotherapy (2019)
链接地址：https://doi.org/10.1007/s00262-019-02347-3

虽然作者这里使用的代谢组学数据，本质上仍然是记录表达量。：
Global metabolomic profiling was performed on patient-derived glioblastoma (GBM; n=80) and LGA (n=28) tumor samples using LG/GC–MS.

1. 基于PATHWAY的热图
   

2. 基于PATHWAY的火山图
   

PATHWAY的具体含义
pathway在我这里是基因集的别名，其中msigdb有着丰富的基因集，MSigDB（Molecular Signatures Database）数据库中定义了已知的基因集合：http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb 包括H和C1-C7八个系列（Collection），每个系列分别是：

H: hallmark gene sets （癌症）特征基因集合，共50组，最常用；
C1: positional gene sets 位置基因集合，根据染色体位置，共326个，用的很少；
C2: curated gene sets：（专家）校验基因集合，基于通路、文献等：
C3: motif gene sets：模式基因集合，主要包括microRNA和转录因子靶基因两部分
C4: computational gene sets：计算基因集合，通过挖掘癌症相关芯片数据定义的基因集合；
C5: GO gene sets：Gene Ontology 基因本体论，包括BP（生物学过程biological process，细胞原件cellular component和分子功能molecular function三部分）；
C6: oncogenic signatures：癌症特征基因集合，大部分来源于NCBI GEO 发表芯片数据；
C7: immunologic signatures: 免疫相关基因集合。

3. 个性化分析代码

##### GSVA个性化分析 #####
library(tidyverse)
library(ggplot2)
library(clusterProfiler)
library(GSEABase)
library(GSVA)
# setwd('/public/igenebook/GRCh38_p13_AJRS2200903005_20210414/personal_analysis/heatmap')

##创建gmt文件转list对象函数
gmt2list <- function(gmtfile){
  sets <- as.list(read_lines(gmtfile))
  for(i in 1:length(sets)){
    tmp = str_split(sets[[i]], '\t')
    n = length(tmp[[1]])
    names(sets)[i] = tmp[[1]][1]
    sets[[i]] = tmp[[1]][3:n]
    rm(tmp, n)
  }
  return(sets)
}
#读取基因集数据库（gmts数据集:从GSEA官网MsigDB下载）
#读入gmt文件，这个可以从MSigDB上下载，这边选的上gene symbol根据自己的data来选择
gmt_file="/public/database/MSigDB/msigdb_v7.4_GMTs/c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt"
geneset = gmt2list(gmt_file)
geneset <- getGmt(gmt_file)
geneset2 <- read.gmt(gmt_file)

#读入exp文件
exp <- read.table('/public/igenebook/GRCh38_p13_AJRS2200903005_20210414/AJRS2200903005/Result/03.Exp/All_sample_counts.xls',row.names = 1,header = T,sep = '\t')

# gsva分析
es <- gsva(as.matrix(exp), geneset,verbose=TRUE)
# es <- gsva(as.matrix(exp), TERM2GENE=geneset2,verbose=TRUE)
head(es)
dim(es)

library(limma)
adjPvalueCutoff <- 0.1
logFCcutoff <- 1
group_list = c(rep("U251NC",3),rep("U251SH1",3))
design <- model.matrix(~ factor(group_list)) # ctr在前,treatment在后
colnames(design)=levels(factor(group_list))
row.names(design)<-colnames(es)

contrast.matrix<-makeContrasts(paste0(unique(group_list),collapse = "-"),
                               levels = design)
contrast.matrix<-makeContrasts("Trt-ck",
                               levels = design)
# contrast.matrix ##这个矩阵声明，我们要把progres.组跟stable进行差异分析比较

##step1
fit <- lmFit(es, design)
##step2
fit2 <- contrasts.fit(fit, contrast.matrix)

fit <- eBayes(fit2)
allGeneSets <- topTable(fit, coef="ctr_vs_treatment", number=Inf)
DEgeneSets <- topTable(fit, coef="ctr_vs_treatment", number=Inf,
                       p.value=adjPvalueCutoff, adjust="BH")
nrDEG = na.omit(DEgeneSets)
es_heatmap <- es[row.names(es) %in% row.names(nrDEG),]

library(pheatmap)
library(patchwork)
#绘制热图
annotation_col = data.frame(
  Type = factor(rep(c("U251NC", "U251SH1"), each=3))
  #Time = 1:3
)
rownames(annotation_col) = c(paste("U251NC",1:3, sep = "_"), paste("U251SH1", 1:3, sep = "_"))

p <- pheatmap(es_heatmap, show_rownames=1, show_colnames = F,annotation_col = annotation_col,
         fontsize=9, width=15, height=12)
png('GSVA.png')
p
dev.new()
#也可绘制火山图