用Hifiasm组装基因组：（二）Hifiasm软件的算法

(约2300字)

1. Hifiasm软件的基本算法

Hifiasm软件由哈佛大学李恒团队在2021年2月份发表在Nature Methods上。

Hifiasm组装主要分为三步：

1. 校正测序错误
2. 构建分型字符串图（phased string graph）
3. 单倍体分型组装

Figure 1. Hifiasm算法概况 图片来源：https://www.nature.com/articles/s41592-020-01056-5

1.1. 校正测序错误

1. 尽管Hifi reads使用CCS测序模式已经进行了一轮校正，准确性已经比CLR测序模式高很多，但仍然会有部分测序(<1%)错误。
2. Hifiasm进行所有序列的相互比对(all-versus-all)来校正可能的测序错误。
3. 在比对中基于reads间的overlap关系来校正错误。如果在比对的同一个位置出现两种碱基类型（不考虑gaps），且每个碱基类型至少有3条reads支持，那么这个位置会被当作杂合位点（SNP）被保留。在这一步，Hifiasm可以对杂合SNP进行定相/分型（phasing）。
4. 如果达不到上述条件的两碱基比对，两种碱基中较少的一种被视作测序错误，将被校正（默认三轮校正）。值得注意的是，Hifiasm只使用相同单倍型的数据进行纠错，从而避免过度校正，保留来自不同单倍型的杂合变异信息。

1.2. 构建分型字符串图（phased string graph）

1. 基于第一步校正后的reads和reads之间的重叠关系（overlap），构建分型字符串图（phased string graph）。
2. 以调整朝向的reads作为顶点(vertex)，一致的overlap重叠区域作为边(edge)，通过气泡 （bubble）的形式形成多条路径来表示杂合位点信息，因而可以保留下来基因组上全部的单倍型信息，以便后续对于单倍型的处理。

1.3. 单倍体分型组装

HiFi-only assembly 模式：如果没有其他数据，如亲本数据，Hi-C数据，使用此模式进行单倍体分型组装。

1. hifiasm 会随机选择每个气泡的一边构建primary assembly（与 Falcon-Unzip 和 HiCanu 类似的主装配）。
2. 对于杂合基因组，由于存在一个以上的纯合haplotype，因此primary assembly可能还会包含haplotigs。
3. HiCanu 依靠第三方工具（如 purge_dups20）来去除多余的haplotigs。Hifiasm 集成实现了 purge_dups 算法的一个变体，简化了组装流程。

2. Hifiasm(trio)算法：Trio-binning模式

如果样本的亲本也进行了测序，则可以使用Trio-binning模式。Trio-binning模式主要在单倍体分型组装步骤上与上面不同。

Hifiasm的trio-binning模式基于2018年发表的TrioCanu软件的trio-binning策略，并进行改进。

2.1. 早期软件TrioCanu

1. 2018年开发的 TrioCanu软件的trio-binning策略先将三代reads区分为来自父本、母本以及部分无法区分的reads，对区分后的reads分别组装获得了子代的两套单倍体序列。
2. TrioCanu软件的trio-binning策略的一个主要缺陷是，一部分杂合子reads无法明确地划分为亲本单倍型：如果双亲在某个位点上都是杂合，那么这个位点无法给reads提供有效的kmer信息，并且reads不能被唯一地被分配给一个亲本单倍型；如果父本在一个位点是杂合的，而母本是纯合的，则reads也无法唯一地被分配给母本单倍型。在标准的trio-binning策略中，无法区分的杂合reads在两个亲本数据集中都会使用。因此，两个亲本的等位基因可能存在于一个单倍型组合中，从而导致错误的重复。另外还可能存在将reads错误划分到其中一个亲本的情况。
3. 总言之，TrioCanu软件的标准trio-binning策略无法清楚地分离两个亲本单倍型。

Figure 2. TrioCanu软件的trio-binning策略 图片来源：https://www.nature.com/articles/nbt.4277

2.2. Hifiasm的trio-binning模式

1. 与TrioCanu软件的trio-binning策略不同，Hifiasm使用了graph-binning的策略对此进行了改进。

• Hifiasm 不预先划分reads，而是利用亲本特有的 k-mer trio binning 对字符串图（string graph）的reads进行标记。
• 因此在一个代表一对杂合等位基因的长bubble中，即使只有一小部分reads被正确标记，hifiasm也可以正确地将其分型。
• 标记之后，hifiasm 会有效地剔除母本的unitigs来生成父本的序列，反之亦然。

2. Hifiasm的trio-binning模式的优势

• 通过这种方式，可以避免因为reads分型错误而引入的错误位点和组装断裂，避免错误地将双亲等位基因放在一个单倍型组装中，从而获得更完整和更准确的单倍体组装结果。
• 这种基于三元组分选的图（graph-based trio binning）可能会经过三元组（trio）中所有三个样本的杂合区域，对错误分型的reads的鲁棒性更高。

3. Hifiasm的trio-binning模式修复分型错误

• 基于 Hi-C 或 Strand-seq 的分型可以明确地对大多数杂合reads进行分型，自然不会出现错误的重复。
• 不过，它们也有标准trio-binning策略的共同问题：分配给错误亲本单倍型的reads可能会破坏contigs（Figure 3）。
• 通过考虑 HiFi reads 分型和组装图（assembly graph）的结构，Hifiasm 可以识别并修复这类分型错误。

Figure 3. 错误的reads分型在Hifiasm的trio-binning模式中会被修正 图片来源：https://www.nature.com/articles/s41592-020-01056-5

3. 新算法Hifiasm(Hi-C)：Hi-C Integrated assembly 模式

李恒团队2022年在Nature biotechnology上发表论文Haplotype-resolved assembly of diploid genomes without parental data（https://www.nature.com/articles/s41587-022-01261-x），在Hifiasm中引入了新算法Hifiasm(Hi-C)，可以使用Hi-C Integrated assembly 模式进行单倍体分型组装。

3.1. Hi-C Integrated assembly模式

1. Hi-C Integrated assembly模式针对PacBio HiFi (High-Fidelity) 长读长测序技术和Hi-C (High-Throughput Chromatin Confirmation Capture) 测序技术进行了全新的设计。
2. 在无亲本数据的情况下，利用至少30倍覆盖度的HiFi数据和至少30倍覆盖度的Hi-C数据也可以获得二倍体生物的单倍型解决的组装结果。
3. 它建立在分型 hifiasm 组装图 （assembly graphs）的基础上，但在序列分类（sequence partition）方面与已发表的 hifiasm (trio) 算法不同。
4. 在 hifiasm graph中，每个节点（node）都是由相位正确的 HiFi reads组装而成的unitig，每条边（edge）代表两个unitigs之间的重叠。
5. Hifiasm（trio）算法在亲本 k-mers 的unitigs中标记reads，但 Hifiasm（Hi-C）用 Hi-C reads对相对较短的unitigs进行分类。

3.2. Hifiasm(Hi-C)算法

1. Hifiasm（Hi-C）算法，先检索unitigs中的 31-mers，并将 Hi-C reads 映射到这些unitigs中，而不进行详细的碱基比对。如果来自 Hi-C 片段的一对reads与两个unitigs上的两个远距离杂合子相匹配，就会在unitigs之间添加一个单倍型特异性 "link"，从而提供远距离的相位信息。
2. 然后，把unitigs分类到两个类别中，使每个类别中的unitigs几乎没有冗余，并且每个类别共享许多 Hi-C "link"。
3. 这样就将单元双分类问题简化为图最大切割（Max-Cut）问题，并通过随机算法(stochastic algorithm)找到接近最优的解决方案。
4. 还考虑了组装图 （assembly graphs）的拓扑结构，以减少局部最优的概率。
5. 最后，使用与 Hifiasm（trio）算法相同的图分选策略(graph binning strategy)，生成最终的 Hifiasm（Hi-C）组装结果。

Figure 4. Hifiasm（Hi-C）算法 图片来源：https://www.nature.com/articles/s41587-022-01261-x

3.3. Hifiasm（Hi-C）算法与其他工具相比的优势

与现有基于Hi-C组装单倍体基因组的方法不同，Hifiasm（Hi-C）算法直接在 HiFi 组装图上运行，并将 Hi-C read mapping、分型（phasing）和组装紧密集成到一个单一的可执行程序中，而不依赖外部工具。它更易于使用，运行速度更快。

4. references

1. Hifiasm paper：https://www.nature.com/articles/s41592-020-01056-5
2. Hifiasm （Hi-C Integrated assembly 模式）paper：https://www.nature.com/articles/s41587-022-01261-x
3. Hifiasm介绍：https://www.bilibili.com/read/cv18775152/
4. https://www.jianshu.com/p/9dc0b5c5af81

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