口腔微生物输入量的差异决定了与健康状况相关的两种微生物群肺炎类型
〉原文：Differential Oral Microbial Input Determines Two Microbiota Pneumo-Types Associated with Health Status
〉网址：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202203115
〉发表：2022 年 8 月 28 日
〉翻译：雪垆，2022-08-30
〉编号：PaperTr-F003
摘要
口腔和上呼吸道在解剖学和生理学上与下呼吸道和肺密切相关，口腔和上呼吸道微生物对肺微生物群的影响越来越被人们认识。然而，由于缺乏足够样本量的对照分析，口腔和上呼吸道微生物塑造肺微生物群的生态过程和个体异质性仍不清楚。在这里，对唾液、鼻腔、口咽区和支气管肺泡灌洗液样本的微生物群落进行了分析，并测量了多源微生物对肺微生物群的形成过程。发现口腔和鼻腔微生物输入通过占据不同的生态位共同塑造肺微生物群。 还观察到口腔微生物向肺部的扩散是不均匀的，进入肺部的口腔微生物越多与肺功能下降和肺促炎细胞因子增加有关。这些结果描述了肺微生物群的外部塑造过程，并表明口腔样本（如唾液）在临床环境中监测和评估肺微生物群状态方面的巨大价值。
1 引言
肺曾一度被认为是无菌的。然而，近年来，宏基因组研究证实了健康个体肺中存在共生细菌。[1-3]这可能与训练宿主免疫有关，特别是呼吸系统[1，4，5]，但它们的起源有争议。[6，7]肺和下呼吸道与上呼吸道和口腔相连，有多项研究报道鼻腔和口腔内的微生物参与了肺微生物群的形成。然而，由于缺乏定量数据和对个体差异的解释，这一过程仍不清楚。[8-10]
据报道，不同身体部位的微生物群之间存在相互作用，[11-13]其中口腔和肠道微生物群的相互作用近年来获得了相当大的关注。[14-18]据报道，口腔微生物群的破坏是肠炎、关节炎和红斑狼疮的一个风险因素。 [14-16] 有趣的是，在结直肠癌患者的肠道中鉴定出累积的口腔分类群，如具核梭杆菌。[17, 18] Ding等人报告说，口腔和肠道微生物群的组成不具有可比性，但微生物群落类型在这些部位之间是可以相互预测的。[19] 基于这些研究，研究人员最近发现口腔和肺部微生物群之间具有临床意义的相互作用。Dickson等人发现，来自Prevotella 属、链球菌属、韦氏菌属和奈瑟氏菌属的微生物(以前在口腔中常见)在健康个体的肺中也占主导地位。 [8, 20, 21] 此外，Segal等人观察到，肺部微生物群富含口腔类群与Th17细胞增殖、肺部炎症途径的上调以及肺癌患者的不良预后有关。 [9, 22, 23] 上呼吸道和下呼吸道在解剖学上是紧密相连的，细菌可以通过空气和鼻腔分泌物进入肺部。[24] 近年来，越来越多的证据表明，上呼吸道细菌群落在防止呼吸道病原体感染黏膜表面并扩散至下呼吸道中起着重要作用。对于大多数呼吸道细菌病原体来说，在引起上呼吸道、下呼吸道或播散性呼吸道感染之前，必须在上呼吸道定植[25, 26] 。
用于研究肺部微生物群的主要采样方法包括痰液样本、[27] 支气管吸液、[28] 支气管肺泡灌洗液（BALF）、[20] 和支气管内膜活检。[29] 虽然这些方法推断或直接测量肺部微生物群组成，但它们容易被污染且生物量低。[30] 因此，肺部微生物群的特征仍然具有挑战性。尽管近年来肺部微生物群研究取得了很大进展，但在很大程度上仍受到技术困难的限制，包括从患者身上收集有创BAL标本以及从低生物量样本中分离、培养微生物并对其进行测序。鉴于口腔和呼吸道之间的联系和生物量交换，唾液等口腔标本可能为肺部微生物群分析提供高度优化的解决方案。然而，为了评估这种方法的合理性，必须评估口腔和上呼吸道微生物群的变化对肺部微生物群异质性的贡献程度。
为了回答这个问题，并系统地研究口腔和鼻腔等上游来源对肺部微生物群形成的作用，我们招募了67名肺癌患者和32名患有非恶性肺部疾病的志愿者，收集了他们的唾液、鼻拭子、口咽拭子和BAL样本。我们将宏基因组测序和细胞因子分析与详细的临床信息相结合，分析了口腔和肺部微生物群之间的系统相关性。我们发现，口腔微生物为肺部的大多数优势类群做出了贡献；然而，这些贡献是高度异质性的。这种个体异质性形成了独特的口腔和肺部微生物群，其特征与宿主肺部健康密切相关。
2 结果
2.1 口腔和鼻腔微生物通过占据不同的生态位对肺部微生物组作出贡献
我们从16s rRNA基因测序数据中分析了BAL、鼻腔、唾液和口咽拭子样本的微生物组成，并以Bray-Curtis距离计算这些样本之间的相似性。这些相似性在主坐标图（PCoA）上被可视化，显示BAL、唾液和口咽的微生物群组成在第一轴上与鼻腔的微生物群组成明显分开（图1a，PERMANOVA，p < 0.001）。BAL样本中最丰富的菌属包括链球菌（平均值±SD，37.5%±15.7%）、奈瑟菌（14.41%±6.93）、Prevotella 7（13.85%±5.16）和嗜血杆菌（12.3%±10.8）（图1b），与以往的研究一致。 [2, 8, 9] 我们使用16sPIP[31]数据库来识别潜在的致病扩增子序列变体（ASVs），并检测到大量来自Prevotella 7、链球菌和奈瑟氏菌属（图1b）。鼻腔拭子的微生物群组成与其他三种样本类型的微生物群组成不同；主要的菌属包括柯氏杆菌（33.5%±20.15）、葡萄球菌（25.1%±22.14）和厌氧球菌（3.84%±5.36）。
b) ASVs的系统发育树，其中尖端点的形状表示微生物的类型（共生微生物或潜在病原体）。热图的透明度表示微生物的丰度，热图的颜色表示人体的不同部位。柱状图表示身体各部位最普遍的物种的相对丰度。
c) 以唾液为来源的中性模型拟合结果。蓝色实线代表拟合曲线，蓝色虚线代表95%的置信区间。决定系数（R^2^）是中性模型的适合程度。它的范围从≤0（不适合）到1（完全适合）。
d) 中性模型中细菌的相对丰度。
e) 多源中性模型的拟合结果。点的颜色代表提供细菌的身体部位。细菌根据其在肺部的频率进行分组（上四分位数和下四分位数）。表中的数字代表每组中每个身体部位提供的分类群的数量。PCoA：主坐标分析；PERMANOVA：permutational multivariate analysis of variation。框图：中心线，中位数；框限，上、下四分位数；误差条，95%CI。组间差异用Wilcoxon检验评估，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001。
接下来，我们用一个中性模型来衡量上呼吸道和口腔微生物组对肺部微生物组组合的相对贡献（中性模型的细节在辅助材料中提供）。中性模型的拟合度（R2）值为：唾液0.7334，口咽0.714，鼻腔-0.0987（R2≤0，不拟合；R2=1，完全拟合）（图1c（唾液），图S2a（鼻腔和口咽），辅助材料）。我们观察到，BAL中最常见的细菌（包括Prevotella 7、Neisseria、Streptococcus、Veillonella、Haemophilus、Fusobacterium和Allprevotella）符合唾液-BAL中性模型，表明肺部的优势细菌主要由口腔提供（95% Wilson得分区间，图1d和图S2b，辅助材料）。基于中性模型理论，这些结果表明，口腔和口咽部的微生物是肺部微生物群的主要塑造来源，而鼻腔微生物进入肺部可能受到宿主和环境因素的阻碍（图1d和图S2b，辅助材料）。
接下来，我们将唾液、口咽和鼻拭子微生物群结合起来，作为重新匹配的中性模型输入，构建了一个多源中性模型，以评估来自不同来源的细菌对肺部微生物群组装的贡献（图1e）。与单源模型的结果相似，口腔和口咽仍然为多源中性模型贡献了大部分高频细菌。尽管大多数鼻腔贡献菌种在肺部检测的频率较低，但这里的贡献菌种数量是最高的（128种）（图1e）。这个多源中性模型的结果表明，肺部微生物群的形成是一个多源过程。口腔和口咽是肺微生物群的主要组成部分，而鼻腔提供的微生物较少见且数量较少。
2.2 口腔细菌进入肺部形成两种肺部微生物群落类型
在随后的分析中，我们选择唾液样本作为口腔和口咽的代表，因为口腔和口咽在塑造肺部微生物群方面发挥着类似的作用。为了定量测量个人的口腔和肺部微生物群的交流强度，我们使用 SourceTracker[32] 来计算唾液微生物对肺部微生物群的贡献。有趣的是，口腔微生物对肺部微生物群的贡献得分呈双峰分布（图2a），表明交流可分为高强度和低强度模式。为了进一步研究这些模式是如何影响肺部微生物群的，我们用这种贡献得分的谷值作为分界线来定义两种微生物群类型并比较它们的差异（图2a）。根据口腔细菌对肺部微生物群的贡献，两种肺部类型被定义为高口腔输入型（HOIT）和低口腔输入型（LOIT）。为了验证这种分类的合理性和稳健性，我们还对BAL数据应用了Dirichlet 多项式混合物（DMM）[33]模型方法，并确定了两种肺部微生物群类型（图S3a，辅助材料）。虽然算法和所需的输入数据不同，但我们的结果在两种方法之间高度一致（图2b和表S1，Fisher’s test p < 0.001，辅助材料）。最后，我们比较了配对的唾液和BAL样本之间的距离，发现HOIT的距离明显低于LOIT（图2c，Bray-Curtis距离，Wilcoxon检验p < 0.0001）。
b) 基于Bray-Curtis的PCoA显示，HOIT（n = 71）的BAL样本与LOIT（n = 28）的BAL样本分开聚类。表中的内容显示了两种方法的结果分布。图中红圈表示分类结果不一致的四个样本。
c) 肺炎类型的BAL和唾液样本之间的配对Bray-Curtis距离。
d) ANCOM和LEfSe显示了肺炎类型之间的不同属种。ANCOM结果中的W值越大，肺型之间的差异就越明显。
e) 核心微生物群热图显示了LOIT和HOIT的不同样本的分类群丰度和流行率。所列分类群是根据LEfSe和ANCOM的结果选择的。ANCOM：微生物组的组成分析；LEfSe。线性判别分析效应大小。框图：中心线，中位数；框限，上、下四分位数；误差条，95%CI。肺型之间的差异用Wilcoxon检验评估，* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001。
为了验证肺型是我们队列中肺部微生物组异质性的最重要的解释因素，我们用方差分割分析（VPA）评估了肺部微生物组差异的所有因素。我们发现，肺型对肺部微生物组的解释力高于其他因素（图S3b，VPA：R2=10.2，辅助材料）。我们观察到两种肺型的微生物群在组成上有明显的差异（图S3d，Bray-Curtis距离，PERMANOVA，P＜0.001，辅助材料）。HOIT组的阿尔法多样性明显较高（图S3c，香农指数，Wilcoxon检验 p=0.0034，辅助材料）。我们还比较了肺癌患者和健康志愿者之间的肺部微生物组差异。我们观察到肺癌患者和志愿者之间的微生物群α多样性（图S3e，Wilcoxon检验 p>0.05，辅助材料）或微生物群组成没有明显差异（图S3f，PERMANOVA p>0.05，辅助材料）。此外，我们发现肺癌患者和志愿者之间的肺型分布没有明显差异（卡方检验，P>0.05）。总的来说，在我们的研究中，肺型是肺部微生物组的最重要的解释因素。因此，我们在随后的分析中重点关注两种肺型之间的差异。
为了进一步证明肺炎型的普遍性在不同人群中是普遍存在的，我们选择了两个公共数据集进行验证（PRJNA269493 和 PRJNA316098）。我们根据自己的数据构建了一个随机森林模型分类器，对另外两个数据集进行分类（图S4a,b，辅助材料）。外部数据集的结果显示了与我们的数据相似的肺类型组成（图S4c-f，辅助材料）。
18个属在HOIT或LOIT组中差异富集（表S2，辅助材料）。Prevotella 7、Fusobacterium和Veillonella属在HOIT中显著富集，而Pseudomonas、Acinetobacter和Brevumdionas在LOIT中显著富集（图2d）。对于含有用于下游分析的足够生物质材料的55份BAL样本，鸟枪法宏基因组测序表明，Prevotella melaninogenica、Neisseria subflava和Neisseria mucosa在HOIT中显著富集（表S2，辅助材料）。一些在HOIT中富集的菌属通常被认为在口腔空间定居（如Prevotella 7、奈瑟氏菌和Veillonella），而在LOIT中富集的菌属（如假单胞菌、痤疮杆菌和柯氏菌1）在口腔空间中很少见，但在鼻腔中有很高的流行率和丰度（图2e）。
2.3 肺部类型的群落组成特征和微生物功能差异
采用中性模型来评估群落的构建过程。在两种肺型中，口腔和肺部微生物群的交流过程都符合中性模型（R2值均>0），而LOIT的决定系数（R2）和扩散系数（m）（R2 = 0.6379, m = 0.0126）（图3a）小于HOIT（R2HOIT = 0.8819, m = 0.0418）（图3b），这表明LOIT人群对微生物从口腔和上呼吸道向肺部的传播有更多的制约。LOIT组中贡献于鼻腔的物种数量明显高于HOIT组，表明鼻腔微生物在塑造肺部微生物群方面也起着关键作用，尤其是在LOIT人群中。我们进一步使用归一化随机性比率（NST），评估群落组成中随机过程的比例，并观察到HOIT中随机过程的比例更高（图3c）。细菌的生态位广度代表了BAL样本中细菌的普遍性和相对丰度，在HOIT中明显高于LOIT（图3d）。主要的口腔细菌，如 Veillonella、Prevotella 7 和链球菌在肺部的生态位广度在不同的肺型之间有明显的不同（图3e）。这些结果共同反映了肺型之间群落构建的差异。
c)将NTS随机分配100次，以比较肺群落构建过程中随机过程的比例。
d)生态位宽度最高的前15个分类群在不同肺类型间的生态位宽度存在显著差异。
f)热图的自上而下模块分别代表临床表型注释、微生物群表型、属特征、抗性基因和毒力基因。箱线图:中心线、中线；箱限值，上四分位数和下四分位数；误差线，95%置信区间；NST:归一化随机比。采用Wilcoxon检验评估了肺类型之间的差异，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，*** p < 0.0001。
我们进一步探讨了每个肺型的肺部微生物表型和功能。我们使用Bugbase[34]来预测肺部微生物组表型中的生物体水平（图3f）。与LOIT相比，我们观察到HOIT的肺部微生物组中嗜睡厌氧菌的比例更高，合成生物膜的潜力更强（图S5a，辅助材料）。使用ShortBRED方法，我们还观察到大量的抗生素耐药性和毒力基因在HOIT中被富集；大多数抗生素耐药基因是大环内酯耐药基因（ErmB、ErmF、ErmX和mel）（图3f）。这些发现与以前的一项研究一致，该研究表明，呼吸道核心抗性组是由大环内酯抗性基因组成。 [35] 病毒性基因也大多富集在HOIT中，包括作为肺癌潜在风险因素的5，10-亚乙基四氢叶酸还原酶多态性，以及催化脂多糖（LPS）生物合成第一反应的UDP-N-乙酰葡糖胺酰基转移酶（图3f和图S5b，辅助材料）。
同样，我们也观察到不同肺型之间唾液微生物组的表型和功能的差异。HOIT组的唾液厌氧菌比例明显高于LOIT组（Wilcoxon检验，P = 0.021）。我们使用 HUMAnN 2 对唾液微生物组的遗传潜力进行了分析（图S5c，辅助材料），发现有43个基因被不同程度地富集，其中33个基因在HOIT中富集，主要参与病毒蛋白和运输工具的合成（图S5d，辅助材料）。
2.4 不同类型的肺病患者在口腔和肺部的微生物相互作用方式有显著差异
我们选择了最丰富的属，并使用成分数据稀疏相关算法（SparCC）[38]，分别为HOIT组和LOIT组患者的BAL和唾液微生物群构建了生态相互作用网络（图4a）。LOIT的交互网络的度数和平均路径长度都大于HOIT（图S6a，辅助材料）。为了量化分类群损失对网络连通性的影响，我们使用Ruiz等人的方法来衡量网络的 “攻击鲁棒性”，即依次删除节点并测量剩余的最大连接成分相对于其起始大小的大小。[39] 我们观察到LOIT的曲线下面积（AUC）大于HOIT（图4b），表明HOIT中BAL和唾液的网络鲁棒性低于LOIT。
b) 四个网络的鲁棒性曲线。 网络的攻击鲁棒性是通过根据所选节点的度数依次移除节点并测量留在中心连接部分的节点百分比来测量的。我们对四个网络中的每一个都进行了鲁棒性的测量，结果在这里被绘制出来，X轴上是被移除的节点百分比，Y轴上是中央连接部分中剩余节点的百分比。每个网络在此图上用一条线表示。曲线下的面积越大，表明网络越健全。曲线的颜色代表群体；实线BAL和虚线唾液。
c) 通过Netshift筛选出网络中具有明显差异的节点。X轴代表NESH的分数。节点大小代表学位数。节点的颜色代表平均相对丰度。
d) 突出唾液中 Prevotella 7 相互作用网络的共现分析。矩形所圈出的类群在各肺型之间是共同的。NESH: 邻居转移分数。网络是通过保留边缘产生的（相关系数R在-0.4和0.4之间，P<0.05）。
为了评估口腔微生物对肺部微生物群的异质性影响，我们使用Netshift[40]来比较肺型之间的唾液微生物群交互网络差异。Prevotella 7, Prevotella 6, Neisseria, Butyrivibrio 2 和另外12个属被确定为具有高邻居转移（NESH）得分的关键节点，这意味着这些属对两个相互作用网络之间的主要差异做出了贡献，因此被认为是两个肺型之间变化的 “驱动因素”（图4c和表S3，辅助材料）。我们选择了连接度最高的Prevotella 7子网络，以探索这些 "驱动因素 "与其他微生物之间的相互作用的变化（图4d）。我们观察到，Prevotella 7 子网络在每个肺型中都有明显的不同（Fisher test p < 0.001），其中 Prevotella 7 与10个节点相连（9个正的，1个负的），而在LOIT组，它与13个节点相连（5个正的，8个负的）。我们注意到，在HOIT中正相关的三对节点（Prevotella 7 和卟啉菌；Prevotella 7 和 Prevotella；Prevotella 7 和Lachnoanaerobaculum）在LOIT中均为负相关（图4d）。
接下来，为了进一步探索跨身体部位的微生物相互作用，我们在口腔空间和肺部之间构建了一个肺型的相互作用网络，并确定了两者特有的微生物相互作用模式。HOIT中正相关的比例大于LOIT（图5a,b）。然后，我们搜索了两者的重要相互作用节点。在HOIT中，Megasphaera、Atopobium和Butyrivibrio 2是重要节点。在LOIT中，Veillonella是非常重要的（图5c）。这些肺型的口腔和肺部微生物群之间的相互作用网络差异表明，肺部微生物群的特点可以通过口腔反映出来。因此，我们使用随机森林方法评估了唾液微生物群组成预测肺炎型的潜力。我们用不同分类水平的输入数据构建了最佳模型，发现属、ASV和种数据的AUC分别达到0.732、0.844和0.857（图5d）。值得注意的是，在ASV级随机森林模型中，Prevotella 7属的多个ASV被包含在模型变量中（表S4，辅助材料）。
c) 口腔和肺部关联网络中的关键节点，横坐标的值表示网络中节点的边数之和。
d) 不同分类级别的ROC曲线。ROC：受试者工作特征曲线。
2.5肺炎型患者与不同的临床特征相关
为了确定penumo类型是否与宿主的健康状况相对应，我们调查了队列的临床概况（表S5，辅助材料）。我们观察到，与LOIT相比，HOIT表现出明显较低的DLCO.SB和DLCO.VA值（图6a，Wilcoxon检验，P＜0.05）和更长的住院时间（图6b）。DLCO测试是一种无创性的肺功能测试，测量用于气体交换的可用表面积。该指数在不同的呼吸道疾病中通常会下降，包括肺气肿、肺泡炎症和肺纤维化。[41] 我们还观察到不同肺型的BAL细胞因子水平的变化（图6c和图S7a，辅助材料）。白细胞介素（IL）-1α、IL-1β、IL-1RA、PDGF.AA和RANTES的水平在HOIT组显著较高（图6c）。
（DLCO）一氧化碳弥散量，SB的全称是single breath，也就是一口气呼吸法，这是肺弥散功能检查最常用的方法。（DLCO / VA）弥散能力除以肺泡体积。
b) X轴代表住院时间，Y轴代表该时间点的出院患者比例。
c) 肺炎类型之间有明显差异的细胞因子的列表（HOIT=61，LOIT=25）。
d) 方块表示相应的系数，横线表示95%的置信区间。箱形图：中心线，中位数；箱限，上、下四分位数；误差条，95%CI。使用Wilcoxon检验评估肺型之间的差异，* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001。
我们为每个肺功能测量和细胞因子水平构建了一个线性回归模型，将肺型和所有人口学指数作为变量。对于每个模型，我们计算了模型的预测因素和方差膨胀因子（VIF）。结果显示，模型具有预测性能（F检验，P<0.05），预测因子之间的VIF都低于4，表明所有计算的预测因子都是独立的，没有受到其他因素的干扰（图6d,e，也见辅助材料，表S6）。正如预期的那样，每个模型中计算的预测因子都包括肺型，表明肺型是我们队列中肺功能和细胞因子差异的一个重要和不可替代的决定因素。
2.6 口腔微生物输入与肺功能和细胞因子的表达有关
我们为不同富集的微生物、细胞因子水平和肺功能测量构建了一个相关网络。IL-1RA与富集在HOIT的微生物呈正相关，但与富集在LOIT的微生物呈负相关（图7a）。我们还观察到IL-1β与富集在HOIT中的微生物呈正相关，包括Prevotella 7, Porphyromonas, Fusobacterium 和 Treponema 2 （图7a，b）。有趣的是，Prevotella 7 的相对丰度与住院时间明显正相关（图7c，Spearman R = 0.26，p = 0.041）。在肺功能方面，作为HOIT中最丰富的微生物之一的奈瑟菌与DLCO.SB和DLCO.VA呈负相关（图7a），与FRC和FRC/TLC呈正相关。
b) ST值与部分肺功能和细胞因子的相关性散点图。线条代表线性拟合曲线，阴影代表拟合曲线的置信区间。
c) Prevotella 7与住院天数、部分肺功能和细胞因子的相关性散点图。p和R值是通过Spearman相关分析计算的。ST：SourceTracker值。
我们发现，唾液到BAL的SourceTracker值（ST）代表从口腔到肺部微生物群的输入强度，与IL-1α、IL-1RA、VEGF-A和PDGF-AA水平显著正相关，所有这些都在HOIT中升高（图7a、b，Spearman’s p<0.05）。值得注意的是，ST值与DLCO.SB（Spearman’s R = -0.32, p = 0.035）和DLCO.VA（Spearman’s R = -0.35, p = 0.021）有明显但负相关的关系（图7a）。
3 讨论
在这里，我们研究了口腔和上呼吸道微生物塑造肺部微生物群的过程，重点是这种塑造过程的异质性如何与肺部微生物群和健康的人际变化相关。特别是，HOIT组的DLCO比LOIT组差，BAL中的促炎症细胞因子（IL-1α，IL-1β）水平也明显增加。有趣的是，我们观察到口腔和肺部微生物群之间的一致性，其特点是细菌相互作用网络的整体协同性和以Prevotella 7为代表的生态位差异。我们还确定了可用于预测肺部微生物群状况的唾液微生物群特征。这些发现使我们能够更好地了解唾液微生物如何影响肺部微生物群，并增加了开发基于唾液微生物的方法来评估和调节呼吸道健康的潜力。
口腔微生物组在人类健康中的重要性越来越受到重视。[42, 43] 口腔和下呼吸道的接近性和连续性使口腔微生物组成为肺部微生物组的潜在决定因素。以前的研究报道了肺部和口腔微生物群组成的相似性[6, 9]，显示口腔微生物主要通过亚临床微呼吸进入下呼吸道。[20]口腔微生物群可能通过直接或间接调节粘膜免疫力，从而影响致病性，成为细菌转化的驱动力量。 [44] 例如，吞咽困难和意识低下的病人（例如颅脑创伤病人）更容易患肺炎，肺炎通常是由口腔中的细菌群在肺部积聚引起的。 [45] 在呼吸道病毒感染中，口腔微生物群与严重急性呼吸道综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）肺部感染密切相关，尤其是严重的COVID-19患者，其肺部缺氧更严重，有利于口腔微生物群中厌氧菌和兼性厌氧菌的生长。因此，口腔保健至关重要。[46] 虽然这些发现揭示了口腔微生物群对肺部的全面影响，但大多数研究是定性的，缺乏临床环境或应用的证据。因此，我们通过测量口腔微生物进入肺部的强度来解决这一知识空白。我们发现，口腔和肺部微生物群之间的交流强度与肺部细胞因子水平和肺部功能密切相关。
我们根据其组成和口腔输入强度确定了两种肺部微生物群落类型（或肺型）。健康的肺部微生物群在微生物的迁入和消除之间保持着动态平衡。[4, 47] 先天和适应性免疫以及肺部物理解剖的变化可能会导致特定的口腔细菌群迁移到肺部。[48] 使用SourceTracker和DMM模型，我们确定了HOIT和LOIT肺型，并注意到HOIT肺部微生物群表现出更高的多样性，具有更丰富的抵抗和毒性基因。此外，我们观察到不同肺型之间的特定细胞因子表达水平存在明显差异。以前的一项研究报告说，PDGF-AA在从癌前病变向晚期肺癌过渡期间调节VEGF-A的表达。[49] 在我们的队列中，PDGF-AA和VEGF-A的水平在HOIT组都很丰富。RANTES和MCP-1构成了β-化学因子超级基因家族的C-C类。两者都具有炎症特性[50]，在HOIT中富集。
我们还观察到肺炎型之间唾液微生物群的组成和功能的差异。HOIT唾液微生物群中厌氧菌的比例以及与细菌毒力和粘附有关的合成基因的检出率均高于LOIT。在HOIT的口腔中观察到更高水平的人类伽马疱疹病毒相关基因。一些研究报道，人类伽马疱疹病毒在肺部的积累与特定肺部疾病的发生和发展密切相关，如特发性肺纤维化、哮喘和支气管扩张。 [51, 52] 与ATP结合盒（ABC）转运器和糖胺聚糖结合蛋白合成有关的多个基因在HOIT的口腔微生物群中富集，并参与细菌粘附和生物膜的合成，[53, 54] 提示HOIT患者的唾液微生物进入肺部后更容易定植。
我们的研究为今后通过调节或操纵口腔微生物来诊断和干预肺部微生物群提供了理论依据。口腔是呼吸道和肠道微生物群的资源库，[55]可能需要进一步的研究来探索两种微生物肺型与我们研究中看到的高度个体化的唾液微生物群之间的对应关系，因为基于口腔微生物群的肺部诊断和肺部干预可能具有相当的临床意义。虽然以前的研究者对肺部微生物群进行了全面的研究，[8, 9, 20-23]但他们基本上忽略了口腔微生物群的潜在价值。我们发现了口腔和肺部微生物群的共同变异证据。HOIT中口腔和肺部细菌相互作用网络的稳健性低于LOIT，表明HOIT患者的口腔和肺部微生物群对外界干扰的耐受性较差（稀疏的互动网络更容易受到外界干扰）[56, 57] 。
这些肺型形成的具体机制需要进一步探索，但我们的发现提供了宝贵的见解。我们的数据表明，HOIT中的口腔微生物更频繁地进入下呼吸道，可能与上下呼吸道屏障的破坏有关。[58] 这种情况在老年人群中更常见，他们的粘膜免疫屏障相对容易老化，在这一人群的肺部可以观察到口腔细菌的富集。 [59] 宿主自体免疫环境的变化也可能是导致肺炎型的原因，因为据报道，呼吸道内累积的炎症因子与呼吸道的微环境变化有关[60]。
我们的研究有一些局限性。我们只关注口腔和肺部微生物群之间的联系。然而，人类微生物组是一个高度整合的生态系统，应该深入研究身体不同部位（包括不同呼吸道部位）的微生物组之间的相互联系。我们还观察到，一些罕见的菌属，如鼻腔中的Brevundimonas和Bacillus，在口腔中并不存在，但却参与了肺部微生物群的形成，这表明这些细菌在塑造肺部微环境中发挥着重要作用。这值得进一步研究。此外，我们无法在同一受试者身上重复BAL程序，因此，没有进行纵向分析以监测口腔和肺部微生物群的动态特征。鉴于口腔微生物群的节律和周期性以及口腔输入对肺部微生物群的持久影响，对实验动物或人类队列的时间序列观察（使用改进的测量方法）可以全面确定口腔和肺部微生物群的共同动态。
总之，我们的数据揭示了口腔和下呼吸道之间的微生物交流，并部分确定了肺型和呼吸道健康之间的关联。我们的工作揭示了使用口腔微生物作为BAL的非侵入性样本替代品来评估肺部健康的潜力，同时也为口腔微生物群干预措施提供了理论支持，以调节肺部微生物群。
4 实验部分
研究招募和样品收集
本研究招募了67名肺癌患者和32名没有肺部疾病的健康志愿者。所有样本在2019年1月23日和2020年1月17日之间收集。入选的参与者，包括肺癌患者和无肺部疾病的志愿者（研究招募和样本收集的细节在辅助材料中提供），都进行了BAL液、鼻拭子、口咽拭子和唾液的收集。为了避免可能的污染，在收集样本的同时，还收集了两个空管作为阴性对照。
临床信息记录
在支气管镜检查前，收集了每个参与者的临床信息。随后，由两位资深的呼吸科临床医生对人口统计学记录进行审查，收集的信息包括身高、体重、年龄、病史、吸烟史、饮酒史、接触史、遗传史和6个月内的抗生素治疗。两名研究人员独立记录并整理了肺癌患者的所有具体生理和生化指标。这些生理和生化测试包括全血细胞计数、心肌酶测试、紧急生化测试、肺功能测试、肝功能测试和血气分析。
肺功能测量
肺功能测量直接显示肺部状况。MasterScreen/SentrySuite IOS系统（CareFusion Co., California, US）被用来检查肺功能。所有的肺功能测量，包括强制生命力（FVC）、一秒钟强制呼气量（FEV1）、呼气流量峰值（PEF）、FVC的75%时的最大呼气流量（MEF75）、FVC的50%时的最大呼气流量（MEF50）、FVC的25%时的最大呼气流量（MEF25）、最大自主通气量（MVV）、肺总容量（TCL）、残余容积（RV）、功能残余容量（FRC）、肺部单次呼吸的CO扩散能力（DLCO. SB）和DLCO.VA（DLCO除以肺泡容积）是按照欧洲呼吸学会（ERS）和美国胸科学会（ATS）的协议进行的。
核酸提取和宏基因组测序
为了进一步了解DNA提取和测序过程中可能引入的污染，我们收集了DNA提取对照（只用核酸提取试剂提取）和PCR对照（只用PCR试剂提取）。在下面的描述和分析中，采样对照、DNA提取对照和PCR对照被统称为阴性对照。
所有的临床样本、阴性对照和模拟群体都保存在-80℃，直到使用DNA分离试剂盒（Magigene，广东）进行DNA提取。在Illumina HiSeq2500平台上对V4区扩增子进行16S rRNA测序，引物为：515F，5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’；806R，和5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。引物是由Invitrogen公司（Carlsbad, CA）合成的。PCR反应，包含25 µL 2x Premix Taq（Takara Biotechnology, Dalian Co. Ltd., China），1 µL每种引物（10 × 10-3 m），和3 µL DNA（20 ng µL-1）模板，体积为50 µL，通过热循环扩增。94℃下5分钟初始化；30个循环，94℃下30秒变性，52℃下30秒退火，72℃下30秒延伸，然后72℃下10分钟最后延伸。每个样品做三个重复，用BioRad S1000（Bio-Rad Laboratories, CA）混合来自同一样品的每个PCR产物。
阴性对照样品在16S rRNA基因PCR扩增后显示出低浓度（<10 ng µg-1，图S1a，辅助材料），不符合常规测序文库制备的浓度标准。然而，为了进一步了解样品采集和测序过程中可能引入的污染，对这些阴性对照样品进行了测序文库制备。99份BAL样品、87份口咽拭子、86份鼻拭子和81份唾液样品的16s rRNA基因被成功测序，共产生45 150 202个读数（每个样品的平均数±SD：127 904 ± 60 718）。同时，四个阴性对照组的序列读数比临床样本少（每个样本平均±SD：17652±12703）（表S7，辅助材料）。
来自BAL（n = 55）和唾液（n = 58）样本的高质量DNA样本被用于宏基因组测序。标准的细菌基因组DNA混合物（模拟社区）也作为阳性对照提交测序。测序文库是在Illumina平台上使用NEB Next Ultra DNA文库制备试剂盒（NEB，美国）生成的，并添加了索引代码以将序列分配给样品。通过超声处理将样品DNA分割成≈300个碱基对（bp）的片段，将片段进行末端抛光并与全长适配体连接，用于Illumina测序，并进一步进行PCR扩增。使用Agilent 2100生物分析仪（Agilent, USA）分析文库的大小分布，然后在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序。
16S rRNA基因序列分析
16S rRNA基因序列使用微生物生态学定量分析（QIIME2 2019.6）pipeline 进行分析。[61] 原始序列数据使用q2-demux插件进行去多重化和质量过滤，然后用DADA2去噪。 [62] 所有的ASVs用mafft[63]进行比对，并使用fasttree2构建系统发育树。[64] 使用q2-feature-classifier classify-sklearn naive Bayes分类器对ASVs进行分类，序列相似度为99%。BugBase[34]被用来预测基于测序结果的细菌组成。
阴性对照和模拟群落测序结果的评估
本研究中使用了两组模拟群落。模拟群落1包含20个属的48种细菌，而模拟群落2包含7个属的7种细菌。在测序结果中，只有0.80%和0.83%的序列被发现在这组序列之外，表明模拟群落的最终测序结果与模拟标准高度一致（图1b，辅助材料）。采样阴性对照中的前五个ASVs和DNA提取和PCR对照中的前五个ASVs在BAL样品中占的比例非常低（<1%）（表S8，辅助材料）。这些数据表明，测序过程没有造成样品的严重污染，所以在随后的分析中没有分类群被淘汰。
鸟枪法宏基因组分析
宏基因组分析的第一个关键步骤是质量控制和去除原始 reads 中的宿主污染。使用KneadData（v0.7.5）管道或Trimmomatic[65] （v0.33）和Bowtie2[66] （v2.2.3）的组合。运行Trimmomatic时的默认参数如下。“slidingwindow:4:20 minlen:70”。最小长度被计算为输入 reads 长度的70%。使用GRCH38作为宿主参考基因组。Kraken2[67] (v2.0.7)被用来将每个样本的 reads 与构建的数据库进行对齐。与多个数据库条目对齐的 reads 被分配到它们在分类树中的最后一个共同祖先。Braken[68] (v2.5.0)利用所有样品中与数据库有独特映射的 reads ，对分配给内部分类学节点的 reads 进行重新分配。ShortBRED[69] (v0.9.4)被用来量化抗生素抗性和毒力基因的丰度。ShortBRED标记是利用PRE-COMPUTED SHORTBRED MARKERS的参考数据库从被注释的抗生素抗性或毒力蛋白中识别出来的。清晰的 reads 与具有99%序列同一性的标记序列进行了映射。所有的分析都是在基因丰度上进行的，归一化为每百万千碱基的 reads （RPKM）。使用HUMAnN2[70] v0.11.2进行功能分析，其中包括将后处理的 reads 与检测到的物种的pangenomes进行映射，允许对样品中的微生物基因家族进行基于 reads 的量化。确定的基因家族被进一步映射到MetaCyc数据库中，以量化代谢途径。基因家族和通路图谱都根据贡献的生物体进行了分层。对于每个样品，通过计算存在的独特基因家族的数量来计算基因丰富度。
中性模型和NTS分析
为了确定中性过程和选择在肺部微生物组中的相对重要性，中性模型的版本是用R的自定义脚本实现的（辅助材料）。使用R软件包NST计算归一化的随机性比率[71]。
BAL液中细胞因子的测量
对于细胞因子的测定，分析了87名提供足够数量BALF样本的参与者。根据制造商的说明，在MAGPIX系统（Luminex）中使用Luminex人类细胞因子/造血干细胞/生长因子面板（Millipore：HCYTA-60K）对浓缩的BAL中总共48种细胞因子进行了测量。其中包括可溶性CD40配体（sCD40 L）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）、Eotaxin、Flt-3配体、fractalkine、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。生长相关肿瘤基因-α（GRO），干扰素α-2/γ白细胞介素（IFN-α2/IFN-γ），（IL）-1受体拮抗剂（IL-1RA），IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8（CXCL8），IL-9，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13，IL-15，IL-17A，IL-17E，IL-17F，IL-18。IL-22、IL-27、γ干扰素诱导蛋白10（IP-10）、单核细胞趋化蛋白1/3（MCP-1/MCP-3）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬细胞衍生的趋化因子（MDC）、γ干扰素诱导的单因子（MIG）、巨噬细胞炎症蛋白1α/1β（MIP-1α/MIP-1β）。血小板衍生生长因子-AA/-AB（PDGF-AA/PDGF-AB）、激活后调节（RANTES）、转化生长因子α（TGF-α）、肿瘤坏死因子α/β（TNF-α/TNF-β）和血管内皮生长因子-A（VEGF-A）。使用技术重复的平均结果。在少于三分之一的样本中检测到的细胞因子不包括在分析中。FLT.3L、GM。CSF、IFN-a2、IFN-γ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12（p70）、IL-17E、IL-17E、IL-17F、IL-22、MCP-3、PDGF-AB、和TNF-α。使用MILLIPLEX Analyst.V5.1软件分析数据。
统计学分析
非参数Spearman’s相关检验被用来检验连续变量之间的关联。错误发现率（FDR）被用来作为多重检验的控制。线性判别分析效应大小（LEfSe）[72]被用来识别肺型之间的差异性细菌，ANCOM[73]被用来验证结果；只有重叠的结果才会被进行下游的分析。进化树的可视化使用R软件包gtree[74] 进行。微生物群落的差异使用Bray-Curtis异同指数计算，并使用PCoA排序图进行可视化。群落组成的差异用包罗万象的多元方差分析（PERMANOVA）[75] 进行统计评估，并对多重比较进行Bonferroni校正。使用 vegan 包计算阿尔法多样性为香农指数[76] 。
用 R 包 AUCRF(v.1.1)[77] 构建随机森林模型，使用三种类型的组成数据(属级、ASVs 和物种)作为输入。最佳的预测因子是根据模型对受试者分类准确度的平均下降幅度来确定的。SourceTracker[32]（v0.9.8，默认参数）被用来评估供体微生物群的迁移。使用基于DMM算法的方法确定细菌群落类型。[33] 选择具有超过1000个读数的微生物作为核心类群，使用SparCC构建相互作用网络，[38] 并使用1000个引导数来计算相关性和P值。通过保留边缘（相关系数R在-0.4和0.4之间，P<0.05）产生网络，在R中用软件包igraph[78]进行分析，并用Cytoscape 3.8.1进行可视化[79] 。
构建线性模型来检验表型数据（因变量），如肺功能和细胞因子，与自变量，如肺型、本地人、大学、糖尿病、高血压、心脏病、胃病、吸烟、喝酒、性别、TNM分期、年龄、身高、体重和BMI之间的关联。在数据预处理方面，对因变量进行了Shapiro检验[80]，以确定它们是否符合正常分布。由于细胞因子指数不符合正态分布，所以对细胞因子指数进行了对数转换。然后，对这些自变量和因变量进行Spearman相关分析，筛选出与因变量显著相关的自变量，构建了以肺功能和细胞因子为因变量的线性模型。
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