BUSCO评估基因组的完整性

一、概念

        BUSCO 是从单拷贝基因的角度去对基因组的完整性做评估的。

        BUSCO 收集了一个叫做 OrthoDB 的数据库，这个数据库收录了很多物种已经发表的蛋白序列，对这些蛋白序列进行从头的计算聚类，之后生成一个一个的cluster，称为基因家族或者是orthologous groups。每个cluster或者是orthologous groups里面认为他们全部是同源基因，从中去挑选单拷贝直系同源基因来去形成BUSCO数据库。

        https://busco.ezlab.org/

        挑选的过程，首先是基于整个 OrthoDB 数据库里所有的数据在各个分类层级去挑选，在90%物种里面呈现单拷贝的这种group，就当做orthologous groups。它会在不同的分类水平去做单拷贝直系同源基因数据库的构建。比如说真菌层面，植物，动物。再下面又会有哺乳动物的层面，植物又会分单子叶植物的，双子叶植物等等层面的一些数据集。

        BUSCO去做基因组评估的时候，可以做基因组水平的评估，也可以做转录本水平的评估。

        基因组层面评估：先去基因组上预测这些基因，再去做评估，如果说给他是一个注释好的基因集，这个时候提供的是一个蛋白集合，它就直接是去进行同源搜索，再去评估，看BUSCO数据库里面的这些单拷贝基因有或者无；有的话，是完整的还是不完整的；完整的话，是单拷贝的还是多拷贝的。

        转录本层面评估：如果说有一套完整的转录本的集合也可以去评估。首先，tblastn也是同源搜索，同源搜索之后，去对转录本进行读码框预测，预测完的结果还是去进行hmmsearch的搜索(hmmsearch是做蛋白质结构域搜索的)，最终拿到BUSCO评估结果。

二、BUSCO软件安装

        查看软件帮助

三、数据库下载

        BUSCO 评估是基于数据库里面已经生成好的单拷贝直系同源基因来做评估，所以这里如果想要本地加载数据库的话，可以先下载数据库

        使用 busco --list-datasets 命令查看BUSCO里面已有的数据库，需要联网才可以查看，如果服务器不可以联网的话，是查看不了的。

        BUSCO 数据库包含了多个层级的数据库，涵盖了不同的物种分类。比如，细菌类有多个细分数据库，接着是古菌和真核生物的数据库。在真核生物中，又细分为真菌、动物、植物等子类。此外，还有病毒相关的数据库。可以根据自己的物种所属的分类选择合适的数据库进行分析。

        去这里下载自己物种所属的数据库

        下载地址：https://busco-data.ezlab.org/v5/data/lineages/

        比如这里我的物种是拟南芥，属于芸薹属，所以我这里下载https://busco-data.ezlab.org/v5/data/lineages/brassicales_odb10.2024-01-08.tar.gz数据库

        放到服务器上解压

        记住brassicales_odb10文件夹路径，下面运行软时会用到。我这里是/home/daichunyan/test2/test19/buscoDB/brassicales_odb10

四、运行busco

        busco 做评估的时候有两种方式，一种是联网运行，另外一种是本地准备好数据库,本地运行。

        1、本地运行命令

busco -i genome.fa \
    -o brassicales_odb10 \
    -m geno \
    -l /home/daichunyan/test2/test19/buscoDB/brassicales_odb10 \
    -c 40 \
    --offline

        1) -i genome.fa：-i 指定输入文件，这里 genome.fa 是待评估的基因组序列文件，格式为 FASTA。

        2) -o brassicales_odb10：-o 指定输出文件夹的前缀，所有分析结果将保存在以 brassicales_odb10 命名的文件夹中。

        3) -m geno：指定分析的模式。在此命令中，geno 表示执行 基因组模式（Genome mode）分析，适用于基因组装配数据（DNA）。其他模式包括 tran（转录组模式）和 prot（蛋白质模式）。

        4) -l /home/daichunyan/test2/test19/buscoDB/brassicales_odb10：-l 指定使用的BUSCO数据库。在这个命令中使用的是 brassicales_odb10 数据库。这个数据库包含了针对 十字花科植物（Brassicaceae）的一组标志性基因集。

        注：因为我这里组装的是拟南芥的基因组，所以这里选择了brassicales_odb10，如果自己分析的是别的物种，这块要进行相应的修改。这块要使用busco --list-datasets 命令去查一下自己物种应该分类于哪个数据库。

        5) -c 40：指定使用的线程数。

        6）-offline：不联网，用本地数据库去运行

        虽然结果有busco_downloads文件夹，但是这个文件夹为空。

2、联网运行命令

busco -i genome.fa \
    -o brassicales_odb10 \
    -m geno \
    -l brassicales_odb10 \
    -c 10

        联网运行比本地运行命令只是少了一个 --offline 参数。还有 -l 参数不需要指定本地下载好的数据库，只需要提供数据库的名字，软件就会自动下载，使用这个数据库了。

        联网先把要用的数据库下载下来，直接去运行BUSCO评估。因为BUSCO数据库是国外的网站，国内下载会比较慢。所以建议可以先把数据库下载下来，直接使用本地运行命令，运行速度会好点。

          结果有busco_downloads文件夹，这个文件夹里有下载的数据库

五、查看结果

        看一下本地运行命令和联网运行命令得到的结果是一致的

        查看short_summary.specific.brassicales_odb10.brassicales_odb10.txt文件。

        C: 99.2%：表示在总 BUSCO 基因组中的完整 BUSCO 基因数所占比例是 99.2%。该值表示输入的基因组序列中有 99.2% 的基因是完整的。

        S: 97.9%：其中 97.9% 的 BUSCO 基因是单拷贝基因（single-copy），没有重复，基因组序列中仅存在一次。

        D: 1.3%：其中 1.3% 的 BUSCO 基因是重复基因（duplicated），在基因组序列中有多个拷贝。

        F: 0.1%：表示有 0.1% 的 BUSCO 基因是碎片化的（fragmented），部分基因不完整。

        M: 0.7%：表示有 0.7% 的 BUSCO 基因缺失（missing），基因组序列中未找到这些基因。

        n: 4596：表示使用的 BUSCO 基因组数据库中的 BUSCO 基因总数是 4596 个。

        4560 Complete BUSCOs (C)：在基因组中检测到 4560 个完整的 BUSCO 基因。

        4500 Complete and single-copy BUSCOs (S)：在完整 BUSCO 基因中，4500 个是单拷贝的基因。

        60 Complete and duplicated BUSCOs (D)：在完整 BUSCO 基因中，有 60 个是重复的基因。

        3 Fragmented BUSCOs (F)：在基因组中检测到 3 个 BUSCO 基因是碎片化的，说明这些基因并不完整。

        33 Missing BUSCOs (M)：有 33 个 BUSCO 基因在基因组中未检测到。

        该基因组有 99.2% 的基因完整（包含单拷贝和重复的基因），其中绝大部分（97.9%）为单拷贝基因。

        仅有 0.7% 的基因缺失和 0.1% 的基因碎片化，表明基因组的完整性非常高。

        说明该基因组的组装质量较好，适合进一步分析和注释。

        结果解读部分摘抄自：https://mp.weixin.qq.com/s/GPxFoqQSVQ3iTrzdFju2Yw

六、评估结果可视化

        这里可以使用BUSCO软件包自带的generate_plot.py去画图

mkdir BUSCO_summaries
cp ./*/short_summary.*.txt  BUSCO_summaries/
python ~/software/busco/scripts/generate_plot.py -wd BUSCO_summaries/

        -wd BUSCO_summaries 去指定输出文件所在目录名称，它是用R去绘图。

        绘制出的busco_figure.png图是下面这样的，即对short_summary.specific.brassicales_odb10.brassicales_odb10.txt文件上的内容进行一个展示

        会把数据库里面的这些单拷贝同源基因，基于评估结果分了几类：

        首先是有和无，红色的这部分就是Missing(M)，在数据库是里面有的，但是在基因组上没有预测出来的这部分单拷贝直系同源基因。Missing(M)越多，表示基因组的组装情况不太好。

        在数据库里面有，在基因组上也预测到的这些基因分成两类，一类是片段是完整的，一类是片段是不完整。不完整的片段(fragmented(F)越多，基因组组装的情况可能也越不好。

        完整的这部分又会分成完整的单拷贝 (Complete(C) and single-copy(S)）和完整的多拷贝 (Complete(C) and duplicated(D))。因为数据库收集的时候找的就是在不同的物种间都是单拷贝的基因，所以说在评估的物种里面应该也是单拷贝的状态才对。但它现在出现了多拷贝，大概率是基因组组装结果里面存在重复导致的。所以如果自己组装的基因组里面duplication比例很高，并且你这个物种没有很近期的全基组复制，大概率是自己基因组组装结果存在着冗余。