MultiQC整合多个质控结果

一、 MultiQC介绍

​FastQC、Qualimap 和RSeQC等不少生信工具都可以给样品生成一个评估结果，但是几乎所有的质控工具都是针对单个样本生成一个报告
​
MultiQC，基于Python的小工具能把多个质控结果整合，其强大的功能主要体现在以下三个方面：

1）能将测序数据的多个QC结果整合成一个HTLM网页交互式报告，同时也能导出pdf文件；
2）支持多种分析类型的质控结果查看，如：RNAseq、Whole-Genome Seq、Bisulfite Seq、Hi-C和MultiQC_NGI；

二、安装MultiQC

## 安装conda
## 安装python2环境
##conda create --name python2 python=2.7 -c https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda/ -y

conda activate python2	##激活python2环境（conda）

##conda install multiqc
conda install -c bioconda -c conda-forge multiqc

multiqc .	##运行测试

三、MultiQC使用

1、将需要测评的数据用FastQC测评（详细操作见 “Fastqc安装运行（jdk安装）”）
2、以下为三份测评结果：

prefetch SRR15971001
prefetch SRR15971005
prefetch SRR15971013
##下载三份测评SRA数据
fastq-dump --gzip --split-files  SRR15971001
fastq-dump --gzip --split-files  SRR15971005
fastq-dump --gzip --split-files  SRR15971013
##--gzip参数是为了生成压缩为gz格式的fastq文件，以节省磁盘空间
fastqc SRR15971001_1.fastq.gz
fastqc SRR15971001_2.fastq.gz
fastqc SRR15971005_1.fastq.gz
fastqc SRR15971005_2.fastq.gz
fastqc SRR15971013_1.fastq.gz
fastqc SRR15971013_2.fastq.gz
##双端测序，所以生成的是正向和反向文件，所以都需要测评
multiqc .

**中途退出的话，要重新 conda activate python2 ##激活python2环境（conda）
**再者需要将以上解压分析后的文件转移到一个文件夹下进行评估

html报告可以直接网页打开就可以查看
multiqc_data文件夹，包含一些数据基本的统计信息和日志文档

四、结果分析：

1. General Statistics
   

所有样本数据基本情况统计

%Dups——重复reads的比例，该六个样本重复reads的比例都很高，说明有用的reads很少
%GC——GC含量占总碱基的比例，比例越小越好（主要看这个GC含量）测序中的GC偏好指的是基因组上GC含量在50%左右的区域更容易被测到，产生的reads更多，这些区域的覆盖度更高，在高GC或者低GC区域，不容易被测到，产生较少的reads，这些区域的覆盖度更少。
M Seqs——总测序量（单位：millions）

2. Sequence Counts
   
   序列计数
   这里可以看到重复reads，六个重复reads比例都偏高，说明这些样本的序列中有用的reads数目较少

3. Sequence Quality Histograms
   

每个read各位置碱基的平均测序质量
绿色区间——质量很好
橙色区间——质量合理
红色区间——质量不好
此处可以看出6个样本均落在绿色区间，测序质量良好

4. Per Sequence Quality Scores
   

具有平均质量分数的reads的数量

绿色区间——质量很好
橙色区间——质量合理
红色区间——质量不好
可以看出这六个序列的整体测序质量还是很不错的，所有的都在绿色区域

5. Per Base Sequence Content
   

每个read各位置碱基ATCG的比例
结果显示六个序列都报错，说明每个位置每种碱基出现的概率差别很大，可能有过表达序列的污染

6. Per Sequence GC Content
   
   reads的平均GC含量
   正常的样本的GC含量曲线会趋近于正态分布曲线，曲线形状的偏差往往是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差（overrepresented reads）。形状接近正态但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差
   这里结果显示部分序列被报错，从形状上来看曲线和正态曲线相差甚远，可能是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差造成的

7. Per Base N Content
   

每条reads各位置N碱基含量比例
当测序仪器不能辨别某条reads的某个位置到底是什么碱基时，就会产生“N”，统计N的比率，正常情况下，N值非常小

8. Sequence Length Distribution
   

序列长度分布
对于这六个序列，每次测序仪测出来的长度主要都在75bp

9. Sequence Duplication Levels
   

每个序列的相对重复水平

10. Overrepresented sequences
    

文库中过表达序列的比例

11. Adapter Content
    

接头含量