PE测序中read1与read2关系

1、前言

  涉及的基础概念部分，详见参考文件1；

  插入片段介绍，详见参考文件2；

  reads1、reads2即为对某个插入片段测序的结果。本文着重介绍1个插入片段的fastq=>bam的过程。为了加深理解，仿照参考文件3，拿自己数据复现一遍。

  至于为什么有这篇文章，原因借用思考问题的熊的话：

很多东西就是这样，你以为的明白并不是真的明白，一年前的明白和一年后的明白也不是同一个明白。我这么说，不知道你能明白还是不明白

2、插入片段与PE测序的3种关系

  数据量固定下，在插入片段略大于PE测序读长时(不测通)，测序效过最好；

  测通时最差，得到的reads数据都是被接头污染，需要舍弃掉，直接分析对结果有影响(SC序列比例高)。原因是，测序数据只会去掉5’端接头序列，reads的末端保留3’端的接头序列，比对时会认为是Softclip序列。

（1）不测通

（2）有重叠

（3）测通

3、插入片段不测通时PE_reads间关系

（1）fq中的reads

# read1
@A00812:653:HCCHGDSX5:1:1261:18285:34068 1:N:0:TTAGGTCG+AGTGACCT
GAGAGATCAGCTAGTGGGAAGGCAGCCTGGTCCCTGGTGTCAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCCACCTCCTTACTTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAGTTTGGCCAGCCCAAAATCTGTGATCTTGA
+
FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF

# read2
@A00812:653:HCCHGDSX5:1:1261:18285:34068 2:N:0:TTAGGTCG+AGTGACCT
TTACCTTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGACGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCA
+
FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF,FFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFF,F::FFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFF:FFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFF:F:FFF,::FF:FF,FFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFF,FFFFF

（2）bam中的reads

# bam中read1(原序列反向互补)
A00812:653:HCCHGDSX5:1:1261:18285:34068	83	chr7	55259494	60	141M	=	55259425       -210	
TCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAG	
FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF	
NM:i:0	MD:Z:141	MC:Z:141M      AS:i:141	XS:i:0	RG:Z:EDT27243129B1D2L4

# bam中read2
A00812:653:HCCHGDSX5:1:1261:18285:34068	163	chr7	55259425	60	141M	=	55259494       210	
TGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCA	
FFFFFFFFFFFFFF,FFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFF,F::FFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFF:FFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFF:F:FFF,::FF:FFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFF,FFFFF	
NM:i:0	MD:Z:141	MC:Z:141M      AS:i:141	XS:i:0	RG:Z:EDT27243129B1D2L4

（3）IGV中的reads

红色的是reads2，从左到右，5’=>3’（正链）；

蓝色的是reads1，原序列反向互补，从左到右，3’=>5’（负链）；

read2序列
TGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCA

read1反向互补序列
                                                                     TCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAGCTGATCTCTC
ref序列
TGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAGCTGTATTGTT

结论：

（1）PE测序的read1和read2是两条互补链；

（2）insertsize中方向相对的两条序列，比对到单链的参考基因组之前会先将其中一条read转义，然后进行比对；BAM文件的read1、read2中有一条是反向互补的。

（3）从UCSC、NCBI或Ensembl下载的参考基因组都是正链碱基序列（5’=>3’）

参考文件

1、生信学习笔记：fastp质控处理生成的report结果解读_fastp结果解读_twocanis的博客-CSDN博客

2、一篇文章说清楚什么是“插入片段”？ - 知乎 (zhihu.com)

3、双端测序中read1和read2的关系 - 简书 (jianshu.com)