bwa commands
常用的序列比对软件bwa:
command
对应的多种命令,这里使用的是mem
,即使用BWA-MEM算法进行序列比对。
bwa mem
bwa mem
命令比对:
下方官网上介绍的mem命令:
不同版本的bwa可能不同:(bwa Version: 0.7.10-r789)
其中,常用的参数:
-k INT minimum seed length [19]; 最小种子长度
-T INT minimum score to output [30]; 最小输出分值
-a output all alignments for SE or unpaired PE; 所有比对可能
-Y use soft clipping for supplementary alignments; softclip标记为补充比对
-M mark shorter split hits as secondary; 短的标记为二次比对
-C append FASTA/FASTQ comment to SAM output; 添加注释?
注:关于-C
参数,测试read名称后需以空格分隔、不能有冒号":"、以de/De(description)开头但不能只有De/de(比如,可以是Desc_1),不符合时比对无结果,但是注释的信息是:De:A:o, de:A:i, De:A:1的候补信息(o/i来自哪里?)
示例有注释信息的fastq:
@readName Desc_1
CAGCATCTCCTGGGAA
+
FFFFFFFFFFFFFFFF
bwa mem分值参数说明
bwa mem
比对分值相关参数:
参数 | 默认 | 比对情况 | 分值 | 说明 |
---|---|---|---|---|
-A | [1] | Match | 1 | 1bp比对得1分 |
-B | [4] | Mismatch | -4 | 1bp错配扣4分 |
-O | [6,6] | gap(ins,del) | -6,-6 | 1bp的ins扣6分,del扣6分 |
-E | [1] | gap extension | 1 | 发生extension罚分系数 |
-L | [5,5] | soft clipping | -5,-5 | 在5’端,3’端的softclip扣5分 |
-U | [17] | unpaired read | -17 | 不成对的read扣17分 |
-E
: g+[1]*s (g:gap罚分值, s:gap的长度(从第1bp的gap开始算), [1]:该参数设定)-L
: 按错配/indel,还是按softclip。 是选择分值高的作为最优比对。该分值设定越大,即对softclip的惩罚越大,那么选择最优比对时,更倾向于错配/indel(尽可能的比对上,而不是直接给出softclip),同样带来的弊端就是有很多错配。但是softclip的分值则不在AS中显示
测试分值参数
Test1:序列不同长度
$ BWA mem -M -k10 -T10 ref.fa tst1.fq > tst1.sam
$ cat ref.fa
>seq1
CACGATGTCTCTCCTCTTAATGTGCTGCACATCTGTAGGATGGGGACAAA
该测试主要针对序列的长度,以及有错配/Ins/Del的情况。
其中:
-
-M
: mark shorter split hits as secondary (标记secodary比对结果); -
-k
: minimum seed length [19] (比对的序列最短长度,默认是19bp);这里设定10。这里的seed不是太明白,是否是指read序列,还是有别的含义?测试是序列可比对长度低于该阈值,则不显示比对结果。
-
-T
: 比对的最小分值阈值,默认值30。即比对得分值<30不输出比对结果(结果显示未比对上),比对得分值>=30输出比对结果。这里设定10。[-k]参数的作用优于[-T],就是说,如果[-k]设定长度阈值较高(eg:19bp),而[-T]参数设置较低(eg:10,即分值最低为10),那么当read长度达不到19bp (但比对分值>=10),结果仍认为是未比对上。
-
ref.fa
: fasta格式的参考序列文件; -
tst1.fq
: 输入的fq文件; -
tst1.sam
:输出sam格式比对结果文件。
该测试其他分值参数使用的是默认值,以read id 为 2del2ins
的序列为例计算分值:
- CIGAR值得为:13M2D8M2I12M10S;(M:match;D:del;I:ins;S:softclip)
- AS tag给出比对分值:"AS:i:17"(17分)
- 分值计算:
- match得分:13+8+12=33
- indel罚分:(6+1*2)+(6+1*2) = 16 (ins和del各有两个)
- 最终得分:33-16=17
注意:这里的分值并没有计算softclip,因为softclip的分值是在比对过程中,用于计算:
是将一端的序列视为softclip还是视为可比对(有match、mistmach、indel);
如果按比对的分值>视为softclip分值,则选择比对上结果,反之,视为softclip。
Test2:错配和softclip
测试靠近read两端位置出现错配, 比对结果是match/mismatch还是softclip?
$ BWA mem -M ref.fa tst.fq > tst.sam
$ cat ref.fa
>ref
TCGTCAATTCCAGGCCAGCCCATGAAGTGAGCAGA
比对结果中,分值计算:
readID: "match"是完全match,碱基数35,分值是: 35;
readID: "mis1"第三个碱基有一个碱基错配,比对上的碱基有34,得分值:34+(-4)=30;
(奇怪:这里为什么给到分值(AS)是32?)
readID:"mis1_ins1"是有一个碱基错配,和一个ins。
- 如果按错配+ins,可match碱基是34个,得分是:34+(-4)+(-6)=24;
- 如果从ins处及左端(5')视为6bp的softclip(罚5分),分值是:34+(-5)=29。
- 也就是按softclip分值更高,所以比较结果给出的是softclip。
注意:bwa比对时,如果序列长度和碱基质量值不同,bwa比对结果中不显示该序列,也没有报错。
Test3:参考序列有相似
对bwa比对的一些测试中,发现如果参考序列之间有相似时,要输出所有比对结果的话,情况可能不理想。
比如这是参考序列ref.fa
:(随意编造的)
>ref1
CTACCGATCTGCACTGTAAGCACCCTTATG
>ref2
CTACCGATCTGCACTATAAGCACCCTTATA
>ref3
CTACCGATCTGCACGAACAGCACCCTTATG
>ref4
CTACCGATCTGCACTGTAAGCACCCTTATT
>ref5
CTACCGATCTGCACTATGAGCACCCTTATG
然后使用同样的序列作为test.fq
,就是:
@ref1
CTACCGATCTGCACTGTAAGCACCCTTATG
+
FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF
@ref2
CTACCGATCTGCACTATAAGCACCCTTATA
+
FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF
@ref3
CTACCGATCTGCACGAACAGCACCCTTATG
+
FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF
@ref4
CTACCGATCTGCACTGTAAGCACCCTTATT
+
FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF
@ref5
CTACCGATCTGCACTATGAGCACCCTTATG
+
FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF
进行比对:
bwa index -a is ref.fa # 构建索引
samtools faidx ref.fa # 构建索引
bwa mem -k1 -T1 ref.fa test.fq > test.sam # 默认输出结果
bwa mem -k1 -T1 -a ref.fa tmp.fq > test.all.sam # 比对输出所有结果
默认输出的结果:(候选比对结果会在XA
tag中)
使用-a
参数输出的结果:(与默认在XA
中的相同)
但是直观看的话,比如,ref1输出的比对只有ref1,ref4,直观看ref5也可以(2mis)
但是, 构建ref时,只使用一个序列,比如只用ref5:
>ref5
CTACCGATCTGCACTATGAGCACCCTTATG
test.fq
的文件比对结果则是:全部可以比对上。
更新日志
- 2024.02.22: mem参数说明
- 2023.02.23: 参考序列有相似
- 2021.06.08: 初版