NGS胚系短变异检测_数据分析

子诚之

已于 2024-03-24 17:00:38 修改

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分类专栏：组学数据分析文章标签：数据分析

于 2024-03-23 22:57:13 首次发布

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content

0. basic
1. read alignment
2. variant calling
3. variant filter
4. variant annotation

0. basic

mutation: a change in DNA

somatic
germline

Variants: any difference that exists between any DNA

small variants
- SNV
- INDEL
Large variants
- Structural variance (> 1,000 bps)
  - Copy number variation
  - Translocations
  - Inversions
  - Deletions/insertions
- Chromosomal abberation

Polymorpism: variation that is common in a population (often AF > 1%)

Alleles: the variation in sequence

Genotype: estimating the allele counts in the sample

GATK胚系短变异最佳实践工作流：包括比对，去重，碱基质量分数校准，变异检测，合并多个vcf，过滤，注释等步骤。
在这里插入图片描述

1. read alignment

首先，对参考基因组序列建索引。

# build index
bwa index <reference.fa>

下游gatk要求所有输入文件（fa/bam/vcf）和索引文件中的染色体名称相同。在开始比对之前，最好检查一下输入文件的染色体命名方式。因为更改 fa 中的染色体名称比更改 bam 中的染色体名称更容易。

然后，进行比对和比对后排序。

# reads alignment
bwa mem \
  reference.fa \
  data/demo_R1.fastq.gz \
  data/demo_R2.fastq.gz \
  > alignment/demo.sam

# sort and compression
samtools sort -o alignment/demo.sorted.sam alignment/demo.sam
samtools view -bh demo.sorted.sam > demo.bam

# alignment statistics
#samtools flagstat demo.sam

上述操作也可以通过管道用法提升IO性能。

bwa mem reference.fa data/demo_R1.fastq.gz data/demo_R2.fastq.gz | \
  samtools sort | \
  samtools view -bh > demo.bam

（可选）修改或添加read group字段。

#  add read groups
gatk AddOrReplaceReadGroups \
  --INPUT alignment/demo.bam \
  --OUTPUT alignment/demo.rg.bam \
  --RGLB lib1 \
  --RGPU H0164.2.ALXX140820 \
  --RGPL ILLUMINA \
  --RGSM demo \
  --RGID H0164.2

read group：测序仪单次运行产生的一组reads。如果单个sample制备的单个library在单个flowcell上的单一lane运行，该lane上运行的所有read都属于同一group。如果涉及multiplexing，则来自该lane上不同library运行的每个reads子集将构成不同的group。
在 (S|B|CR)AM 文件中，read group是通过官方规范中定义的一些标记来标识的。这些标记不仅可以区分样本，还可以区分与artifacts相关的各种技术特征，进而可以在重复标记和碱基校准步骤中减轻artifacts的影响。
GATK要求输入文件中有以下几个必需read group字段：
PL：测序平台。本例为ILUMINA。
SM：样本名。来自同一个体的所有比对reads在该字段中应具有相同ID，本例为demo。
LB：文库ID。分子重复只存在于一个文库中。如果一个文库在多条lane上测序，追踪该信息非常重要。本例只测序了一个文库lib1。
ID：read group ID。通常是 flowcell 和 lane 的组合。
（非必需）PU：platform unit。该字段用于标识测序lane，格式为[FLOWCELL].[Lane].[SAMPLE BARCODE]。虽然非必须字段，但如果存在，则在碱基校准时优先于ID。

接着，标记重复。尽管有文献（Ebbert et al., 2016）报道称去除重复对变异分析影响不大。

# Mark duplicates
gatk MarkDuplicates \
  --INPUT alignment/demo.rg.bam \
  --OUTPUT alignment/demo.rg.md.bam \
  --METRICS_FILE alignment/marked_dup_metrics_demo.txt 

# Indexing
samtools index demo.rg.md.bam

最后，为比对文件建立索引，以供下游分析工具使用。

# Indexing
samtools index demo.rg.md.bam

扩展：
bwa manual
samtools manual
Read groups
Ebbert MTW et al. (2016) Evaluating the necessity of PCR duplicate removal from next-generation sequencing data and a comparison of approaches. BMC Bioinformatics.

2. variant calling

gatk需要参考序列的两个索引文件，用下述命令分别创建。此外，如果有输入的外部vcf文件（如dbSNP, 1kg），也需要建立相应的索引。

# reference sequence
samtools faidx <reference.fa>    #.fai索引
gatk CreateSequenceDictionary --REFERENCE <reference.fa>    #.dict索引
# vcf
#bcftools annotate --rename-chrs <tab-delimited-renaming> <input.vcf>
  #gatk要求所有输入文件（fa/bam/vcf）和索引文件中的染色体名称相同
gatk IndexFeatureFile --input <variants.vcf>

然后，进行碱基质量分数校正（BQSR）。BQSR 根据系统误差评估碱基质量。它可以忽略已知变异的位点。BQSR 有助于识别测序错误的碱基，从而降低发现假阳性变异位置的概率。

gatk BaseRecalibrator \
  --reference <reference.fa> \
  --input alignment/demo.rg.md.bam \
  --known-sites <variants1.vcf> \
  --known-sites <variants2.vcf> \
  --output bqsr/demo.recal.table

gatk ApplyBQSR \
  --input demo.rg.md.bam \
  --bqsr-recal-file bqsr/demo.recal.table \
  --output bqsr/demo.recal.bam

使用HaplotypeCaller子命令进行变异检测。

gatk HaplotypeCaller \
  --reference <reference.fa> \
  --input bqsr/demo.recal.bam \
  --output variants/demo.HC.vcf \
  --intervals chr20:10018000-10220000 \   # 仅检测指定区域
  --emit-ref-confidence GVCF \            # 为了后续合并多样本，输出为gvcf，存储非变异位点，从而实现增量分析
  --bam-output variants/demo.phased.bam   # 为了后续可视化单倍型定相，输出定相bam

# get some statistics 
#gatk VariantsToTable --variant variants/demo.HC.vcf --fields CHROM -F POS -F TYPE -GF GT --output variants/demo.HC.table

# 扩展阅读：如何使用R计算PL和GQ？

genotype likelihoods <- function(m,g,e,ref,alt){
    (((m-g)*e+g*(1-e))^alt * ((m-g)*(1-e)+g*e)^ref)/(m^(ref+alt))
}
    #m: ploidy
    #g : number of alternative alleles
    #e : base error probability
    #ref : number of reference alleles counted
    #alt : number of alternative alleles counted

-10*log10(genotype_likelihood(m=2, g=0, e=0.01, ref=22, alt=4))    # PL = 80.96026, when g=0 
-10*log10(genotype_likelihood(m=2, g=1, e=0.01, ref=22, alt=4))    # PL = 78.2678 , when g=1 
-10*log10(genotype_likelihood(m=2, g=2, e=0.01, ref=22, alt=4))    # PL = 440.1746, when g=2 
    #最可能的基因型PL值最小，所以 g=1 (heterozygous)
    #GL值的算法是第二小PL值减去最小PL值，本例为 80.96 - 78.27 = 2.69
        ##本例基因分型质量低，phred尺度转换后错误率达0.54。

（可选）将多个样本的vcf合并到一个数据库。

# generate a GenomicsDB
gatk GenomicsDBImport \
  --variant variants/demo.HC.g.vcf \
  --variant variants/demo2.HC.g.vcf \
--intervals chr20:10018000-10220000 \
--genomicsdb-workspace-path genomicsdb

# retrieve the combined vcf from the database
gatk GenotypeGVCFs \
  --reference <reference.fa> \
  --variant gendb://genomicsdb \
  --intervals chr20:10018000-10220000 \
  --output variants/trio.vcf

3. variant filter

强烈建议在过滤SNP/INDEL时进行VQSR。然而，在数据可用性有限，如非模式生物数据、样本水平（FORMAT字段）过滤等无法应用VQSR的情况下，可以使用硬过滤。

# split SNPs and INDELs, due to different filtering thresholds
gatk SelectVariants \
  --variant variants/demo.vcf \
  --select-type SNP \
  --output variants/demo.SNP.vcf

gatk SelectVariants \
  --variant variants/demo.vcf \
  --select-type INDEL \
  --output variants/demo.INDEL.vcf

# filter SNPs: INFO field (per variant) & FORMAT field (per genotype)
gatk VariantFiltration \
  --variant variants/demo.SNP.vcf \
  --filter-expression "QD < 2.0" --filter-name "QD2" \
  --filter-expression "QUAL < 30.0" --filter-name "QUAL30" \
  --filter-expression "SOR > 3.0" --filter-name "SOR3" \
  --filter-expression "FS > 60.0" --filter-name "FS60" \
  --filter-expression "MQ < 40.0" --filter-name "MQ40" \
  --filter-expression "MQRankSum < -12.5" --filter-name "MQRankSum-12.5" \
  --filter-expression "ReadPosRankSum < -8.0" --filter-name "ReadPosRankSum-8" \
  --output variants/demo.SNP.filtered.vcf

# filter INDELs
gatk VariantFiltration \
  --variant variants/demo.INDEL.vcf \
  --filter-expression "QD < 2.0" --filter-name "QD2" \
  --filter-expression "QUAL < 30.0" --filter-name "QUAL30" \
  --filter-expression "FS > 200.0" --filter-name "FS200" \
  --filter-expression "ReadPosRankSum < -20.0" --filter-name "ReadPosRankSum-20" \
  --output variants/demo.INDEL.filtered.vcf

# merge filtered SNPs and INDELs
gatk MergeVcfs \
  --INPUT variants/demo.SNP.filtered.vcf \
  --INPUT variants/demo.INDEL.filtered.vcf \
  --OUTPUT variants/demo.filtered.vcf

使用VQSR完成位点水平（INFO字段）的变异过滤。

# create sites-only VCF, to speed up the analysis in the modeling step
gatk MakeSitesOnlyVcf \
  -I demo.vcf.gz \
  -O demo_sitesonly.vcf.gz

# calculate VQSLOD tranches for indels
## population resource files gs://gcp-public-data--broad-references/hg38/v0
## The parameters are tuned for WGS. For WES, https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035531612-Variant-Quality-Score-Recalibration-VQSR?id=1259
gatk VariantRecalibrator \
  -V demo_sitesonly.vcf.gz \
  --trust-all-polymorphic \
  -tranche 100.0 -tranche 99.95 -tranche 99.9 -tranche 99.5 -tranche 99.0 -tranche 97.0 -tranche 96.0 -tranche 95.0 -tranche 94.0 -tranche 93.5 -tranche 93.0 -tranche 92.0 -tranche 91.0 -tranche 90.0 \
  -an FS -an ReadPosRankSum -an MQRankSum -an QD -an SOR -an DP \      
  -mode INDEL \
  --max-gaussians 4 \
  -resource:mills,known=false,training=true,truth=true,prior=12:Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg38.vcf.gz \
  -resource:axiomPoly,known=false,training=true,truth=false,prior=10:Axiom_Exome_Plus.genotypes.all_populations.poly.hg38.vcf.gz \
  -resource:dbsnp,known=true,training=false,truth=false,prior=2:Homo_sapiens_assembly38.dbsnp138.vcf \
  -O demo_indels.recal \
  --tranches-file demo_indels.tranches

# calculate VQSLOD tranches for SNPs
gatk VariantRecalibrator \
  -V demo_sitesonly.vcf.gz \
  --trust-all-polymorphic \
  -tranche 100.0 -tranche 99.95 -tranche 99.9 -tranche 99.8 -tranche 99.6 -tranche 99.5 -tranche 99.4 -tranche 99.3 -tranche 99.0 -tranche 98.0 -tranche 97.0 -tranche 90.0 \
  -an QD -an MQRankSum -an ReadPosRankSum -an FS -an MQ -an SOR -an DP \
  -mode SNP \
  --max-gaussians 6 \
  -resource:hapmap,known=false,training=true,truth=true,prior=15:hapmap_3.3.hg38.vcf.gz \
  -resource:omni,known=false,training=true,truth=true,prior=12:1000G_omni2.5.hg38.vcf.gz \
  -resource:1000G,known=false,training=true,truth=false,prior=10:1000G_phase1.snps.high_confidence.hg38.vcf.gz \
  -resource:dbsnp,known=true,training=false,truth=false,prior=7:Homo_sapiens_assembly38.dbsnp138.vcf \
  -O demo_snps.recal \
  --tranches-file demo_snps.tranches

# filter indels on VQSLOD
gatk ApplyVQSR \
  -V demo_sitesonly.vcf.gz \
  --recal-file demo_indels.recal \
  --tranches-file demo_indels.tranches \
  --truth-sensitivity-filter-level 99.7 \
  --create-output-variant-index true \
  -mode INDEL \
  -O indel.recalibrated.vcf.gz

# filter SNPs on VQSLOD
gatk ApplyVQSR \
  -V indel.recalibrated.vcf.gz \
  --recal-file demo_snps.recal \
  --tranches-file demo_snps.tranches \
  --truth-sensitivity-filter-level 99.7 \
  --create-output-variant-index true \
  -mode SNP \
  -O snp.recalibrated.vcf.gz \