GFFcompare详解

当与参考注释（也作为 GFF 提供）进行比较时，程序 gffcompare 可用于比较、合并、注释和估计一个或多个 GFF 文件的准确性。

Github:https://github.com/gpertea/gffcompare

Reference: http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/gffcompare.shtml

下载与安装

• 源码安装

wget http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/dl/gffcompare-0.12.6.tar.gz
tar -xzvf gffcompare-0.12.6.tar.gz
cd gffcompare-0.12.6
make

• 二进制文件

cd ~/bin
wget http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/dl/gffcompare-0.12.6.Linux_x86_64.tar.gz
tar -xzvf gffcompare-0.12.6.Linux_x86_64.tar.gz

• conda安装

conda install gffcompare -c bioconda 

用法详解

gffcompare基本用法：gffcompare [options]* {-i <input_gtf_list> | <input1.gtf> [<input2.gtf> .. <inputN.gtf>]}

-i	提供一个文本文件，其中包含要处理的（查询）GTF文件的绝对路径，而不是将它们作为命令行参数（当需要处理大量 GTF 文件时很有用）
-h/-help	打印帮助信息并退出
-v/--version	打印版本号并退出
-o <outprefix>	所有输出文件的前缀（例如 .loci、.tracking 等）。如果未提供此选项，则使用的默认输出前缀为：“gffcmp”
-r	可选的“参考”注释 GFF 文件。每个样本都与该文件匹配，并且样本异构体在适当的情况下被标记为重叠、匹配或新颖。请参阅下面的 .refmap 和 .tmap 输出文件说明
-R	如果指定了 -r，此选项会导致 gffcompare 忽略不与 input1.gtf、...、inputN.gtf 之一中的任何转录本重叠的参考转录本。用于忽略 RNA-Seq 样本中不存在的注释转录本，从而调整文件中写入的准确性报告中的“灵敏度”计算
-Q	如果 -r 被指定，这个选项会导致 gffcompare 忽略不被参考注释本中的任何转录本重叠的输入转录本。用于调整文件中写入的精度报告中的“精度”计算
-M	丢弃（忽略）单外显子转录片段和参考转录本（即仅考虑多外显子转录本）
-N	丢弃（忽略）单外显子参考转录本；仍然考虑单外显子反式片段，但它们永远不会找到精确匹配
-D	丢弃单个样本中的“duplicate”（冗余）转录本（即具有相同内含子链的那些）（从而禁用“annotate”模式）
-s 基因组序列的路径（可选）；这将启用“repeat”（'r'）类classmode评估； <genome_path> 应该是多 FASTA 文件的完整路径，最好使用 samtools faidx 进行索引；重复序列必须在基因组序列中被软掩蔽（小写）
-e 评估外显子准确性时，参考转录物末端外显子自由端允许的最大距离（范围）。默认情况下，这是 100。
-d 对转录起始站点进行分组的最大距离（范围），默认为 100。
-p <outprefix>.combined.gtf 文件中用于共有/组合转录本的名称前缀（默认值：'TCONS'）
-C	从 .combined.gtf 输出中丢掉“contained”的转录本。
-A	与 -C 类似，但如果它们从不同的 5' 外显子开始，则不会丢弃内含子冗余的 transfrags（保留备用转录起始位点）
-X	与 -C 类似，但如果 transfrag 末端突出在容器的内含子内，也会丢弃包含的 transfrag
-K	对于 -C/-A/-X，不要丢弃任何与引用匹配的冗余转录本
-T	不要为每个输入文件生成 .tmap 和 .refmap 文件
-V	Gffcompare 对它所做的工作更加冗长，将消息打印到 stderr，它还会显示有关在读取给定 GFF 文件时发现的任何不一致或潜在问题的警告消息。
--debug	启用调试模式，该模式启用 -V 并生成附加文件：<outprefix>.Q_discarded.lst、<outprefix>.missed_introns.gtf 和 <outprefix>.R_missed.lst

输出结果

主要输出结果

• *.*.gtf 主要输出注释文件

  • *.combined.gtf 当提供多个GTF/GFF文件时，gffcompare会产生一个GTF文件，其中包含每个样本中所有转录本的“并集”。如果两个样本中都存在具有相同内含子链的转录本，那么在组合.gtf输出。
  • *.annotated.gtf 如果提供单个GTF/GFF查询文件作为输入，并且没有指定删除“重复的”/“冗余”转录本的特定选项(-D、-S、-C、-A、-X)，则gffcompare将输出一个名为*.annotated.gtf的文件而不是*.combined.gtf文件。

• *.loci 报告每个转录本中每个新的转录本位点信息

• *.stats 报告了与参考注释相比的输入转录本的准确性(或一致性)相关的各种统计数据。

• *.tracking 匹配样本之间的转录本。

• *.stringtie_asm.gtf.refmap 对于每个参考转录本，查询的转录本是完全还是部分匹配到参考转录本上。

• *.stringtie_asm.gtf.tmap 对于每个转录本最佳的参考转录本。

很奇怪的是，我没有得到stat文件，记录一下

gffcompare -r $gtf -o All -i input.list

<outprefix>.tracking

该文件匹配样本之间的转录本。每行代表一个转录结构，该结构在所有输入 GTF 文件中保留（结构等效）。如果所有内含子相同，则 GffCompare 认为转录本“匹配”（即结构等效）。请注意，“匹配”转录本允许在第一个和最后一个外显子的长度上有所不同，因为对于相同的生物转录本，这些长度通常会因样本而异。

如果使用-r选项运行 GffCompare，则第 3 列包含有关与该行表示的转录结构“最接近”（最佳匹配或重叠）的参考注释转录的信息。

Column number	Column name	Example	Description
1	Query transfrag id	TCONS_00403479	转录本中的唯一ID
2	Query locus id	XLOC_006534	super-locus的唯一ID，包含所有样本和参考注释中的这些转录本
3	Reference gene id	TCEA3|rna-XM_006710864.2	与此转录本相关的参考记录的基因名称和转录本ID（用`
4	Class code	c	参考转录本与此行所代表的转录本结构之间的重叠类型或关系

<outprefix>.<input_file>.refmap

Transfrags matching each reference transcript

此制表符分隔的文件列出了每个参考转录本，其中完全或部分匹配该参考转录本。请注意，对于给定的每个<input_files> 都会在该输入文件所在的目录（可能不是当前工作目录）中生成一个这样的输出文件。该文件每个参考转录本行，列如下：

Column number	Column name	Example	Description
1	Reference gene	Myog	此转录本的参考GTF记录的gene_name属性（如果存在）。否则使用gene_id。
2	Reference transcript id	uc007crl.1	此转录本的参考GTF记录的transcript_id属性
3	Class code	c	第4列中的查询记录与参考记录之间的匹配类型。“c”表示部分匹配，或“=”表示完全匹配。
4	Matches	STRG.223|STRG.223.1,STRG.224|STRG.224.1	与参考转录本匹配的以逗号分隔的组装转录本列表

<outprefix>.<input_file>.tmap

Best reference transcript for each transfrag

Column number	Column name	Example	Description
1	Reference gene name	Myog	此转录本的参考GTF记录的gene_name属性（如果存在）。否则使用gene_id。
2	Reference transcript id	uc007crl.1	此转录本的参考GTF记录的transcript_id属性
3	Class code	c	第4列中的查询记录与参考记录之间的class code关系类型
4	Query gene id	STRG.23567	输入转录本（例如Stringtie）内部gene_id
5	Query transcript id	STRG.23567.0	输入文件的转录本ID
6	Number of exons	7	query转录本文件中的外显子数量
7	FPKM	1.4567	The expression of this transcript expressed in FPKM
8	TPM	0.000000	the estimated TPM for the transcript, if found in the query input file
9	Coverage	3.2687	该转录本的平均测序深度
10	Length	1426	The length of the transcript
11	Major isoform ID	STRG.23567.0	The query ID of the gene’s major isoform
12	Reference match length	4370	The length of the longest overlap with a reference, ‘-’ if there is no such exonic overlap

Class code

Num	Flag	Content
1	=	Complete match of intron chain 内含子链的完全匹配
2	c	Contained 预测转录本包含在参考转录本中
3	j	Potentially novel isoform (fragment): at least one splice junction is shared with a reference transcript 潜在的新异构体（片段）：至少一个剪接连接与参考转录本共享
4	e	Single exon transfrag overlapping a reference exon and at least 10 bp of a reference intron, indicating a possible pre-mRNA fragment. 单外显子转录本与参考外显子和参考内含子至少10 bp重叠，表明可能存在前mRNA片段。
5	i	A transfrag falling entirely within a reference intron。完全比对到参考内含子内的转录本
6	o	Generic exonic overlap with a reference transcript 部分外显子与参考转录本重叠
7	p	Possible polymerase run-on fragment (within 2Kbases of a reference transcript)。 可能的聚合酶片段，在参考转录本2k bp范围内
8	r	Repeat. Currently determined by looking at the soft-masked reference sequence and applied to transcripts where at least 50% of the bases are lower case
9	u	Unknown, intergenic transcript。未知，基因间转录本
10	x	Exonic overlap with reference on the opposite strand
11	s	An intron of the transfrag overlaps a reference intron on the opposite strand (likely due to read mapping errors)
12	.	(.tracking file only, indicates multiple classifications)

对于lncRNA的分析主要选择三种class code：i,u,x