原理 rpm_Pacbio测序原理以及SMRT bell文库构建流程简述

​ 2018年发的老文章了，文章不错，所以决定再捞一下。文中有3段视频，如需观看请大家移步“基因Share”观看。

Pacbio测序原理及SMRT bell文库构建流程简述（二）​mp.weixin.qq.com

---

大家好，今天跟大家继续分享关于PacBio SMRT测序仪的相关知识，分享内容主要参考PB官方的《Template Preparation and Sequencing Guide》并以PPT格式展示。

在正式开始分享前，谈一谈关于目前主流基因测序技术的名称问题，很多人将测序技术分为或者叫做一代测序（Sanger测序）、二代测序、三代测序甚至是四代测序，个人认为这个叫法带有强烈的商业宣传动机，举例：因为所谓的一代到四代测序跟全球移动通讯技术（2G、3G、4G、5G）的概念是完全不同的，因为单从上网体验来看，下一代移动通讯技术从任何维度都比上一代要好得多即一代更比一代强，而几种测序技术在测序精确度、单位时间数据产量、平均序列读长、单位数据量成本等主要评价指标上却各有优劣，在不同的科研、临床应用场景中更是如此。

因此对于目前市面上的主流测序技术根据测序原理，分为“双脱氧末端终止法测序”“短读长大规模平行测序”“单分子实时荧光测序”更合适一些，不管是PacBio还是Nanopore都是单分子测序，在文库构建和光信号采集单元（Cluster、DNA Nanoball... ...）的生成的过程中没有PCR的过程，也正基于此，瀚海基因的CenoCare短读长基因测序仪才敢叫“第三代基因测序仪”。

接下来我们主要讨论的就是“单分子实时荧光测序”，而不再称之为“第三代测序”。

以基因组DNA为例（6～20k文库），从建库流程来看与“短序列大规模平行测序”相似，都是将基因组片段化，然后在片段化DNA的两端加上特定的接头序列，主要不同点在于最后bell文库需要与测序通用引物、具有链置换性的DNA聚合酶依次进行结合，形成待测模板、引物、聚合酶的复合物，然后loading到测序芯片上。

SMRTbell文库是单链发卡状的接头，文库两端连接的接头是相同的（Dual index时barcode序列除外）这得益于其滚环测序的原理而不需要像illumina或者MGI的adapter一样需要部分互补、部分游离的结构来实现PCR和双末端测序。

如下图，测序通用引物的5'具有PloyA尾巴，这与其后续利用MagBead方式Loading测序芯片有关，因此测序引物与接头部分互补。

PB提供两种类型的接头序列，一种是我们熟知的A/T粘性末端接头，一种是平末端接头，当插入片段大于250bp时则使用平末端接头，反之使用A/T接头（当然这就意味着99%的情况下，使用平末端）

从下图中可以看出，PB建库、测序试剂包最独特的也就是DNA/Ploymerase Binding Kit了，它作为一个单独的包装出现，而“短序列大规模平行测序”技术中的DNA聚合酶是在测序试剂盒里的，每一个测序Cycle（每读取1个碱基）都需要从试剂槽中抽取酶并且在下一个Cycle进行前冲走。

再来看一下需要的特殊实验仪器以及耗材，基本同“短序列大规模平行测序技术“的要求类似，例如核酸片段化设备仍是Covaris公司产品的天下，但不是我们熟悉的基于AFA原理的核酸片段化仪器，而是一种打断管—g-TUBE（主要用于6～20k的主流SMRT文库构建，如insertion<6K,则使用Covaris AFA设备进行片段化，如果>20k则推荐使用Diagenode公司的核酸片段化设备）。