三代测序技术简介

三代测序技术简介

2017-03-05    编辑：诺禾致源

什么是三代测序

三代测序是指单分子测序技术（Single Molecule Real- Time, SMRT），在测序过程中不需要涉及PCR扩增，不仅实现了每一条DNA分子的单独测序，并且避免了潜在的PCR扩增错误和偏好性。
目前，三代测序技术原理分为单分子荧光测序和纳米孔测序两大阵营，其代表公司分别为Pacific Bioscience和Oxford Nanopore Technologies。现在市场接受度和使用度最高的是Pacific Bioscience三代测序仪，其SMRT技术建立在两项革命性的发明基础之上，从而克服了测序领域的重大挑战。
第一，零模波导孔技术（Zero-Mode Waveguides，ZMWs）让光只能照亮固定了单个DNA聚合酶／模板分子的纳米孔底部。
第二，磷酸化的核苷酸可帮助固定的DNA聚合酶完成一个全天然的DNA链合成过程。

PacBio的三代测序仪

2013年PacBio公司发布三代测序仪RS II System，该系统基于革命性的SMRT测序技术，其平均读长达10,000 bp，最长读长超过20,000 bp。
此系统提供了简单快速的SMRT测序流程，适合传染病、微生物、农业和复杂遗传病的研究。它让科学家能够快速经济地完成基因组组装、揭示并了解表观基因组，以及鉴定基因组变异。目前国内很多公司正在积极引进的Sequel平台，正是PacBio公司推出的最新型号，其原理与RS II System相同，但是测序通量和数据质量有了大幅提高。新平台的引进与应用还需要一段时间，因此目前市面上使用最广泛的仍然是RS II System。

 

表1 本次产品升级亮点

MADS-box

MADS-box 与花、果实发育密切相关，在古老的复制事件发生后分为type I和type II两个分支，尤其是MADS-box type II，对于发育研究具有重要的研究意义。

 

[案例一] 苹果基因组

转录组数据表明，在苹果果实发育的早期与果实成熟期，MADS-box 表达上调；苹果基因组中存在大量的MADS-box（147个），共有91个是type II MADS-box，发生了显著的扩张（表1）。

表1 梨果发育相关基因家族分析

PacBio三代测序基本流程

与二代测序一样，PacBio三代测序的第一步也是建库，其主要区别是建库过程不涉及PCR反应。DNA分子打断之后，经过修复、接头连接、纯化和聚合酶绑定，即可出库准备上机测序。

构建好的文库与oligodT磁珠混合，磁珠携带的polyT与文库DNA的polyA结合。将混合液加入SMRT cell中，磁珠上的DNA分子有一定几率掉入ZMW中，接触并固定在ZMW底部。然后开始进行单分子实时测序，测序的过程与二代测序的SBS相类似，反应体系中充满带有荧光基团的dNTP，DNA聚合酶每合成一个碱基，dNTP的荧光基团就会被激发出荧光，并被光学仪器所捕获，最后转变成碱基序列信息。

PacBio三代测序的优势

优势一 无需扩增，不会人为的引入突变。

优势二 超长读长，平均读长可达到10 Kb，最长读长可以达到40 Kb。

优势三 覆盖均匀，无GC偏好性。

优势四 通过reads的自我矫正，30X以上准确率能够达到99.999%。

优势五 可以直接检测到甲基化信息，同步进行表观遗传学性别识别。