做形态学方法的团队_揭秘，神经细胞如何做ATACSeq

背景

近年来，利用高通量测序技术对转座酶可接近的染色质区域进行测序分析(ATAC-Seq)已成为表观遗传学研究的基本工具。然而，这项技术很难在冷冻细胞样品上进行，因为在提取细胞核之前冷冻细胞会损害细胞核的完整性并改变染色质结构，特别是在神经元等比较脆弱的细胞中。为了克服这个缺点，本文研发了一种与ATAC-Seq兼容的神经细胞冷冻方案。文章选用了一种与疾病相关的细胞类型，即人类诱导多能干细胞(iPSCs)分化而来的运动神经元(iMNs)对该方法进行测试，这些细胞来源于一名脊髓性肌萎缩症患者的成纤维细胞。

文章测试了两种不同的细胞冷冻方法：快速冷冻和缓慢冷冻。快速冷冻是一种使用液氮或干冰迅速降低样品温度的过程，以限制破坏性冰晶的形成。缓慢冷冻是逐渐降低样品的温度，并利用二甲基亚砜(DMSO)等冷冻保护剂防止冰晶成核，限制细胞在冷冻过程中的脱水。

文章发现，快速冷冻的iMNs不适合用于ATAC-Seq，但使用慢冻保存细胞进行测试，该方法是成功的，利用这种方法可以分离出高质量、完整的细胞核进行ATAC-seq，并且还验证了新鲜和冷冻保存的iMNs的表观遗传结果上的一致性。

细胞冷冻

(1) 快速冷冻(Flash-freezing)：将离心后细胞沉淀在液氮中快速冷冻。

(2) 低温保存(Cryopreservation)：将细胞沉淀重悬在低温介质中(例如DMSO)，放入含有异丙醇的冻存盒中 ，-80°C缓慢冷冻。该过程能够实现的− 1°C /分钟的冷却速度。

(3) 将快速冷冻和低温保存的iMNs细胞-80°C低温保存10天。

 细胞解冻

(1) 快速冷冻细胞：从-80°C 取出后，立即悬浮于冷的细胞裂解缓冲液中。

(2) 低温保存细胞：将冻存管从-80°C 取出后，并迅速放入37℃水浴锅快速解冻约2min，然后将样本转移到预热的含有1X蛋白酶抑制剂的1XPBS中。

图1新鲜、速冻和低温保存iPSCs来源的运动神经元的 ATAC-Seq 流程

获得新鲜(f)、速冻(FF)和慢速降温保存(c)的iMNs 的 ATAC-Seq 数据。新鲜神经元和冷冻神经元来自同一个细胞池，并进行平行处理，以评估冷冻对 ATAC-Seq 结果的影响，不存在任何批次效应。

ATAC-seq实验的质控非常重要，是评判实验成败的关键。(1)首先要分离得到高质量完整的细胞核，包括用台盼蓝或 DAPI 染色对细胞核进行形态学观察，从定性角度看，单个完整的细胞核呈圆形或椭圆形，无明显聚团。然后用自动细胞计数器对这些细胞核进行精确定量。(2)其次要有最佳的酶切条件，可以通过凝胶电泳来评估处理后的染色质样本的质量，如Buenrostro et al(Jason D. Buenrostro, 1,2 Beijing Wu, 1 Howard Y. Chang, 2 and William J. Greenleaf1ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide)等人所述：如果染色质是完整的且转座酶反应是最佳的，酶切扩增后的pattern图跟单核小体、双核小体、三核小体DNA长度吻合。

此外，我们以已知的开放染色质位点作为阳性对照，以 tn5不敏感位点作为阴性对照，通过实时 qPCR 分析测定DNA 可接近区域的富集情况，高质量ATAC-Seq样本阳性对照位点的富集程度至少要高出10倍。

结论

1 新鲜和快速冷冻运动神经元(iMNs)的ATAC-Seq

首先在新鲜和快速冷冻的iMNs上进行了ATAC-Seq。图2显示了两个样本代表性的ATAC-Seq结果。细胞核形态学观察: 新鲜细胞的细胞核显微镜观察相对较完整，质量较好；从速冻神经元中提取细胞核则呈现出过多的团块，这可能是由于核膜破裂，细胞核内遗传物质DNA漏出造成的(图2a)。转座酶反应后，通过琼脂糖凝胶电泳定性评判所得到的文库质量。新鲜分离细胞核的文库显示出清晰的核小体定位，而快速冷冻神经元的文库显示出DNA成弥散状(图2b)。

对新鲜样品和快速冷冻样品文库进行二代测序，使用R包Gviz在基因组坐标上绘制测序数据，以进行手动检查轨迹和峰的局部可视化(图2c)。用高活性Tn5酶处理人的total DNA作为阴性对照，并将文库与ATAC-Seq样品一起测序。新鲜神经元ATAC-Seq峰图尖锐，与ENCODE数据库中组蛋白修饰H3K4me3 的ChIP-seq数据信号重叠，MACS2 q值阈值设为0.05的情况下检测到了超过7万个峰。相比之下，快速冷冻细胞的reads均匀分布在整个基因组中，这一点与阴性对照的结果相似，并且仅检测到461个显著峰，这些峰只有一半与新鲜iMNs的峰重叠。这些结果表明，快速冷冻的iMNs不适合进行ATAC-Seq。     

图2新鲜细胞和速冻细胞ATAC-Seq过程中代表性结果

2 新鲜和低温保存运动神经元(iMNs)的ATAC-Seq

接下来文章比较了新鲜和低温保存iMNs的ATAC-Seq结果。取100万新鲜iMNs缓慢冷冻保存，解冻后用细胞通透性染料Hoechst 33342对神经元进行染色，显微镜下观察。如图(图3a)所示；与新鲜细胞核相似，缓慢冻存的神经元核完整而且质量很好，通过凝胶电泳也检测到了核小体的梯化pattern(图3b)。使用Gviz软件包可视化ATAC-Seq轨迹: 新鲜神经元和低温保存神经元的数据均具有明显的尖锐峰和较低的背景信号(图3c)。

 图3 新鲜细胞和慢速冻存细胞ATAC-Seq过程中代表性结果

此外，实时qPCR的结果表明：新鲜样品和低温保存样品在开放染色质位点的富集度较高，但快速冷冻样本的结果较差，富集倍数还不到10(图4b)。

图4实时qPCR评估ATAC-Seq文库的质量

与新鲜细胞的测序分析结果一样，低温保存的样品获得了7万多个重要峰，并且从新鲜和低温保存的iMNs获得的峰在数量和形状上高度重叠。这些结果表明，iMNs的缓慢冷冻保存与天然染色质的表观遗传学分析是一致的。

3. 新鲜和低温保存的iMNs的定量比较

对新鲜和低温保存的神经元进行三次技术重复，评估低温保存的方法是否会引起染色质可及性的改变。总体而言，新鲜样本和低温保存样本的重复性较好(R ≥ 0.978)(图5a)。值得注意的是，低温保存和新鲜样本之间的相关性几乎和技术重复一样高(R ≥0.973)，这表明低温保存成功的保存了reads在整个基因组上的分布。另外，新鲜和低温保存的细胞的转录起始位点的分布高度相似(图5b)。peak在基因组上的分布进一步说明了低温保存和新鲜样本之间的相似性(图5c)。

图5新鲜细胞与慢速冻存细胞的定量比较

讨论

本文建立了一个适合于在 iMNs 上进行 ATAC-Seq 实验的细胞冷冻方案，同时文章也希望此方法能够得到更广泛的应用，例如比较脆弱的原代培养细胞或珍贵的临床样本。

神经细胞非常脆弱，做ATAC-seq的难度较大，甚至有的细胞无法进行慢速冻存。嘉因生物有丰富的神经细胞ATAC-seq经验，处理过的样品类型包括：神经元细胞，小胶质细胞 ，神经干细胞等。感兴趣的老师可以联系我们哈！

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上海嘉因生物科技有限公司致力于表观遗传学在科学研究和临床检测上的应用，是上海市高新技术企业，博士后创新实践基地。在科研服务领域，团队主要产品线有CUT&Tag/ChIP-seq，ATAC-seq，1微克MeRIP-seq，eccDNA测序，单细胞ATAC-seq和单细胞RNA-seq；在临床检测领域，团队开发了一整套针对cfDNA甲基化的实验检测技术和数据分析技术，相关应用产品正在临床实验阶段。       嘉因生物的ChIP-seq技术协助客户发表论文十余篇，近一年所发表的杂志包括Nature Communications，PNAS和Theranostics等；2018年8月1日嘉因生物发布了十万样本ATAC-seq测序计划；2019年1月，嘉因生物的ATAC-seq实验技术协助客户于The Journal of Clinical Investigation发表论文Chromatin remodeling ATPase BRG1 and PTEN are synthetic lethal in prostate cancer，影响因子12.282分；2019年3月，嘉因生物通过了美国10X Genomics 公司的单细胞ATAC-seq产品线的CSP认证，成为国际上首家获得该产品官方认证的企业。此外，2018年9月，嘉因生物于Plos Biology杂志发表1微克RNA的MeRIP-seq实验文章 Refined RIP-seq protocol for epitranscriptome analysis with low input materials，开启了MeRIP-seq技术进入临床医学研究的序幕。