2020.9.10丨Pacbio技术三代建库、测序原理

• 基本概念：
  • 第三代基因测序技术又被为“Single Molecule Real Time (SMRT™) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序技术），该方法基于纳米孔的单分子读取技术，不需要扩增即可快速读取序列。目前，Pacific Biosciences公司已经成功推出了商业化的第三代测序仪PacBio RS平台和PacBio Sequel平台
• SMRT测序原理
  • 步骤1：将磷酸化核苷酸引入零模波导孔（ZMW）
  • 步骤2：核苷酸在检测体积中保持数十毫秒，当被光激发时发出荧光。 捕获的光将转换为具有相关质量指标的基本呼叫
  • 步骤3：聚合酶掺入核苷酸，释放出附着的染料分子
  • 步骤4-5：重复该过程
• SMRTbell™模板介绍：
  • 结构线性
  • 拓扑圆形
  • 模板的结构同质性
  • 提供相同序列的正向和反向链序列
• 测序优势
  • 边合成边读取数据
    • PacBio SMRT技术采用了边合成边测序的思想，使用4色荧光标记碱基；
  • 长读长
    • pacbio读长可以达到10Kb以上；其超长读长的关键在于使用了活性持久且高保真的DNA聚合酶，并以SMRT芯片为测序载体；可以减少拼接成本，节省内存和计算时间，可以用有限的覆盖度finishingGenome；
  • DNA不需要扩增无GC偏好性
    • DNA建库整个过程，不存在PCR扩增的情况，不会引入PCR扩增引起的GC偏好问题，对打限度的保证了读取信息GC比例的准确性
• DNA质量要求
  • •必须为双链DNA（dsDNA）
  • •避免反复冻溶，未经高温处理（>65°C）
  • •DNA保存溶液pH在6-9之间，建议保存于弱酸性换环境；
  • •OD260/280 在 1.8~2.0、OD260/230在2.0~2.2之间
  • •澄清无色，无不溶物；
  • •无RNA的污染；
  • •DNA未接触过紫外、荧光燃料等可能损伤DNA 的环境和物质
  • •不含螯合剂（如EDTA）、二价金属阳离子（如Mg2+）、变性剂（如胍盐，苯酚）、去污剂（如SDS、Triton-X100、CTAB）
  • •DNA电泳条带单一，条带长度≥23kb，无明显降解
  • •Qubit 浓度: Nanodrop 浓度≥0.5（最好接近 1）
• RNA质量要求
  • •浓度>300ng/ul
  • •完整性：RIN值≥8.0；28S/18S>1；基线无上抬或轻微上抬；5S峰正常；
  • •纯度：1.7 <OD260/280<2.2；OD260/230>0.5；260吸收峰正常不偏移;
  • •样品状态：送样粘稠、颜色异常、有浑浊或不溶物均不合格；
  • •电泳：无基因组污染；
  • •样品运送前保存在-80℃冰箱；
• 合成工作流
  • 合成图
  • 建库流程图
    • 合成cDNA
    • 片段分区，PCR扩增
    • SMRTbell™ 成环
    • PacBio® RS II 测序
    • 数据分析
      • 原始数据
      • 清洁数据
      • 聚类
      • 生成转录本
      • 质量过滤
• 测序应用
  • （1）全基因组denovo测序
  • （2）基因组草图的优化或基因组完成图绘制
  • （3）全长转录本测序
  • （4）宏基因组测序
  • （5）16SrDNA全长测序
  • （6）细胞器基因组测序
  • （7）全基因组重测序&稀有变异鉴定
  • （8）表观遗传学