SEQ 1. 测序的前世今生

    最近这几天正好看来一些测序的比对算法，顺便看了测序的原理，从最初的 Sanger 到现在 Nanopore 和 Pacbio，觉得时代更替的真快，变化的措不及防，于是决定增加一个关于测序时代变迁的话题，与行业内外人士共同见证测序的40年。这期分享将帮助大家挑选最适合自己研究工作，临床或诊断应用的测序平台。

---

简   介

新一代测序方法已经被开发并提出用于研究基因组学或涉及 DNA 的临床应用。这些测序方法的技术进步使测序量在很短的时间内和较低的成本内增加到数十亿核苷酸。过去几年中，在大量研究项目中使用最新的 DNA 测序平台有助于改进测序方法和技术，从而使各种各样的研究/评论出版物和测序技术的应用成为可能。目标。该研究旨在通过比较每小时的输出、读取质量、最大读取长度、每次运行的读取量及其在各个领域的应用，突出各公司开发的最快速和最准确的 NGS 仪器。将有助于研究机构和生物/临床实验室选择最适合其环境的测序仪器。最终用户将对测序技术的历史，最新发展和测序技术到目前为止的改进有一个总体概述。最终的研究基于先前的研究和制造商的描述，强调在每小时的输出方面，得出结论：

Nanopore PromethION 优于所有测序仪，华大基因位居第二，Illumina 位居第三。

Nanopore PromethION 是最快的测序方法，华大基因和 Nanopore 可以击败 Illumina，后者是目前最受欢迎的测序公司。

在质量方面，Ion Torrent NGS 仪器排名第一，Illumina 排名第二，BGI DNB排名第三。

其次，需要开发节省内存和时间的算法和数据库来分析第三代和第四代测序方法产生的数据。

介   绍

DNA 测序方法的历史只有60年，但这些方法发展非常迅速，可以说进步的一个杰出的例子，导致巨大的改进和增强成本降低，高通量，能力和应用。DNA 测序的历史始 于Sanger 测序和 Maxam and Gilbert 的方法两种基本方法的引入。聚合链式反应的发展，高质量 DNA 修饰酶的可用性，以及荧光自动化测序使 2001 年首次测序人类基因组成为可能。随后，DNA 测序方法、化学和生物信息学分析方法发生了巨大的革命。

自 2005 年以来，已经开发了几种下一代测序 (NGS) 方法，并提出用于研究基因组学或涉及 DNA 的临床应用。NGS 提出了一种新的测序方法，由多种方法组成，这些方法依赖于制备模板、确定碱基顺序、对齐序列和基因组组装。与传统的突变检测方法相比，NGS 的一个主要优势是能够对多个基因进行测序，并同时突出显示数百万个变异。其他优势包括最少的 DNA 输入，更快的周转时间; NGS 已经彻底改变了基因和基因组发现的速度，并推进了我们对疾病分子机制和潜在治疗方案的理解。这些测序方法的技术进步(用荧光染料代替放射性标记，用毛细管阵列电泳代替凝胶电泳)引入了测序方法的自动化，并在单次运行中将测序量提高到千碱基对。NGS 仪器可以在非常短的时间和低成本内生成数十亿个核苷酸。这些功能使得 NGS 方法可用于许多领域，如全基因组测序 (WGS)、全外显子组测序 (WES/ES)、变体调用 (VC)、靶向测序 (TS)、和转录组测序 (TCS)。在过去的几年中，在大量的研究项目中使用最新的 DNA 测序平台有助于改进测序方法和技术，从而使测序技术的研究和应用范围广泛。每年出版数百份出版物，强调测序技术的重要性。在过去的十年中，已经发表了数十篇优秀的研究，描述了测序方法的优点、缺点和应用，包括 Sanger 测序，也称为第一代测序 (1^st^GS)，NGS 也称为第二代测序 (2^nd^GS)，第三代测序 (3^rd^GS) 和第四代测序 (4^th^GS)。测序方法的历史揭示了这些技术的惊人发展和改进速度，这些技术现在使我们能够以非常低的成本和高速对所有物种的基因组进行测序。

从第一代到第四代测序方法的详细概述测序方法。对 Illumina、Ion Torren、GenapSys、QIAGEN 和华大基因 等公司最新和最流行的测序仪器的技术特点进行了总结和比较。提出的研究突出了最有效和准确的 NGS 仪器，并帮助研究人员和临床医生通过最适合他们的仪器进行 DNA 测序。这项研究将为最终用户提供历史、背景化学和序列技术的最新发展的知识，并帮助他们根据自己的需求选择最合适的 NGS 仪器。

高通量测序技术的发展

2005 年之前进行的包括人类基因组计划在内的使用 DNA 测序方法的初步研究通常被称为 1^st^GS(1970)。其中最著名的 是 Sager、Maxam 和 Gilbert 发现的测序方法。采用 1^st^GS 方法测序 DNA 速度慢，成本高，因此需要快速、廉价的 DNA 测序技术。基于大规模并行测序概念的 2^nd^GS方法于 2005 年问世。最流行的 2^nd^GS 平台由罗氏生命科学公司、赛默飞科学公司、Illumina 公司和应用生物系统公司开发和商业化。这些方法也被称为 NGS 平台，并彻底改变了 DNA 测序。与 1^st^GS 相比，NGS 有几个优点。一些更重要的好处是:

(1)大量的吞吐量，产生大量的短 DNA序列，并行读取，

(2)高速度，

(3)低成本。

NGS 方法生成的reads长度在50 ~ 300 bp之间。NGS 技术分为杂交测序和合成测序 (SBS) 两大类。合成测序 (SBS) 实际上是 Illumina 测序技术，是产生世界上 90% 序列数据的最流行的方法。3^rd^GS 方法 (2010) 包括单分子测序 (SMS) 和 True 单分子测序 (tSMS)。这些技术需要较少的起始 DNA 材料，并且不需要扩增模板 DNA 。第4次测序 (2014年) 也被称为纳米孔测序，主要包括牛津纳米孔技术 (ONT) 的 MinION。这种方法实际上在 3^rd^GS 中结合了纳米孔技术。4^th^GS 能够实时对固定细胞和组织进行测序，而不需要在合成阶段进行扩增和重复循环。下图显示了测序方法的演变。

详细概述测序方法

第一代测序

DNA 测序的第一个里程碑，称为 Sanger 测序，于 1977 年发布。该方法采用合成测序 (SBS) 方法，采用双脱氧链终止技术，对与模板链互补的放射性标记 DNA 链进行测序。然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳研究这些片段。该技术随后得到改进、自动化，并可用于商业目的，被称为 1stGS。主要改进包括引入毛细管电泳和凝胶电泳;用荧光标记的 DNA 代替放射性标记的 DNA 利用重组确保了进一步的进展 DNA 和 PCR 技术。1^st^GS 的主要缺点是只能生成/分析一个序列电泳道或毛细管。这是原因将 DNA 分裂成片段 Reads 长度测序准确率为99.99%。该方法的主要限制是低通量和高成本。例如，这个过程非常昂贵，以至于人类基因组计划耗费了近13年时间和27亿美元。后来，对 1^st^GS 的改进使测序成为可能另一个人类基因组耗资 1000 万美元。然而,随着随着时间的推移，1^st^GS 达到了极限，被占领了这是一种昂贵的方法。需要注意的一点是，这项技术仍然用于验证 DNA 序列和靶重测序按时间顺序排序方法的演变。

第二代测序

NGS，高吞吐量和大规模并行测序是用于这种类型测序的特点。它也被称为2^nd^GS。这种方法无需将测序反应分离成通道、毛细血管或管。NGS 允许数十亿测序过程同时平行地发生在滑动表面(玻璃或珠)上，与 1^st^GS 相比，在吞吐量和成本方面有了巨大的改进。

1. Illumina

Illumina 是各种测序仪器的领先制造商。目前，提供了许多测序平台，分为两类:

BenchtopSequencers (BTS)和Production Scale Sequencers (PSS)。

所有BTSs都支持

(1)微生物和病毒等小生物的WGS，

(2)靶基因测序(TGS)，

(3)靶基因表达谱(TGEP)，

(4) miRNA和sRNA分析谱，

(5)16S宏基因组测序(MS) (iSeq100除外)。

NextSeq 550系列和NextSeq 1000 & 2000有额外的应用，如外显子组测序(ES)， s-细胞分析，芯片序列分析，甲基化测序，MS和无细胞测序(CFS)。BTS的对比如表1所示。在pss中，只有NovaSeq 6000支持人、植物和动物的WGS。其他pss提供的功能与台式测序器类似。表2概述了pss的应用程序、特性和性能。HiSeq 2500、HiSeq 3000、HiSeq 4000、HiSeq X 10和HiSeq X 5已宣布停产(Illumina, 2021年)。但是，技术支持将持续到2024年3月31日。

Illumina 测序方法是基于 SBS 的。反应系统是 DNA 聚合酶，引物和 4 dNTP与碱基特异性荧光标记物的混合物。NTP 的3 '-OH 确保每次添加一个碱基。测序反应完成后，DNA 聚合酶和未使用的 dNTP 被洗脱。然后加入缓冲溶液进行荧光激发。荧光信号由光学设备记录。光信号，由光产生 设备，用于基地呼叫。为了进行下一轮测序反应，使用化学试剂猝灭荧光信号并去除dNTP 3'-OH保护组。同一实验产生的测序数据长度相同。最新的测序平台可以产生成对的 DNA 序列 (22 × 300 bp)，即可以读取片段的两端。不正确的解读导致了信号衰减和失相荧光标记或终止部分。测序平台的平均错误率为1-1.5%。

2. Ion Torrent

Ion Torrent 于 2011 年推出。离子激流是一种基于SBS的方法，并使用 pH 值测量产生核苷酸序列。离子流生成的测序 reads 长度不同。离子激流测序机不能从片段的两端生成测序。有四个离子激流仪器; GeneXus 系统能够在一天内使用自动化工作流程生成数据分析报告，只有两个接触点。这对于最低的样品输入是经济的，并且可以放置在实验室或家庭中，无论 NGS 专业水平如何。这也被称为内部 NGS 系统。Ion GeneStudio S5系统支持高效，可扩展和低成本的靶向测序。基于 Ion 芯片，该仪器有五种变体，能够在单次运行中生成2M至1.3 m个读取和0.3至50 Gb的数据，耗时 3-21.5 小时。表3 描述了Ion GeneStudioS5 系统的应用程序、性能和特性。PGMDx 系统适用于调节实验室环境和体外诊断。它是一个集成了 NGS仪器、试剂、耗材和测序和数据分析软件工具的 系统。Ion Chef 系统是 Ion GeneStudio S5 系统的改进版本。它是一种自动制备离子 AmpliSeq 库、可复制模板和加载芯片的方法。

3. GenapSys

GenapSys (成立于2010年)是斯坦福基因组技术中心的一家公司。GenapSys Sequencer 通过嵌入增强 SBS 技术 核苷酸结合物的热检测。这是一个体积小(不到10磅)，价格低廉，使用方便，甚至对基因组领域的初学者来说也是不错的。电芯片上有数百万个传感器，每个传感器都有一个头包裹着成千上万个核苷酸的克隆拷贝序列。DNA 碱基以一种顺序，成功的合并是由变化引起的随着互补 DNA 链的生长而产生阻抗。根据不同的传感器数量，该芯片有三种版本可供选择:100万个传感器、1600万个传感器和100万个传感器1.44亿个传感器。这项技术使音序器产生大范围的数据量。为例如，拥有1600万个传感器芯片的 GenapSys 能每天产生1300万次，Read长度150bp，精度等级>80% 大于Q30(精度99.9%)。但是，它的性能可以得到增强通过一组芯片连接到ES、TS和SCP。GenapSys 可用于鉴定病原体、sRNA、sWGS、靶向mRNA, SCP和基因编辑。

4. QIAGEN

QIAGEN 提供 GeneReader 用于 NGS 数据生成。通过匹配 GeneRead QIAcube 克隆扩增的荧光信号模板来检测核苷酸。GeneReader 只能由经过 MB 方法培训的合格人员 和 GeneReader 本身使用。据称，具有完整的工作流程，可消除样品制备过程中面临的挑战，并提供对结果的非常好的理解。GeneReader 系统有助于所有样品处理和测序阶段，如 DNA 提取，文库制备，测序，生物信息学数据分析，临床意义和证据。利用 “QCI Analyze” 和 “QCI Interpret” 对生物数据进行分析、变异调用及其标注、读取映射、比对可视化。质量(大于85% Q30)确保在运行级别验证每个变体，以最大限度地减少假阳性和假阴性适应症。

5. Complete Genomics Technology/BGI

Complete genomics 成立于 2006 年，是一家专门从事全人类基因组测序的公司。2013年，被世界领先的基因组服务机构之一的中国BGI收购。华大基因为研究、农业、医疗和环境应用提供了一系列测序(表4)和数据分析工具以及技术。全基因组学通过杂交和结扎等新兴测序技术发展了一种技术，称为 DNA 纳米 球(DNA nanoball,DNB) 测序。滚动圈复制用于将 440-500bp 的 DNA 片段扩增为 DND。这需要在生成纳米球之前生成整个圆形模板。将 DND 倒入流动池中，每个孔中有一个纳米球。从1到10的模板碱基以与精确调用化学相当的成对端方式处理在 SOLiD 测序。消除结扎后序列，新的探针添加，根据各种碱基的位置，退火、洗涤、并对所有位置迭代图像读取靠近一个适配器的一端。此过程将对适配器的所有剩余终端执行。主要的 DNB 测序的缺点是运行时间短读取长度。这种技术的主要优点是大量的 DND (近3.5亿)。后来,采用 Retrovolocity 方法可在8天内生成50倍覆盖率的高质量 WG 和 WE 序列。根据他们的说法，超过2万人类的整个基因组已经被测序适当的工具和程序。

6. Roche 454

罗氏 GS-FLX 454 基因组测序仪是 2004 年推出的第一个商用系统，名为 454 测序仪。利用该平台，对个体(James D. Watson)的第二个完整基因组进行了测序。罗氏公司于 2008 年推出的升级版 454 GS FLX Titanium 系统将平均读取长度和准确度分别提高到 700 bp 和 99.997%。该平台在24小时内每次运行提高了0.7 Gb的数据输出。GS Junior 台式测序器系统的平均读取长度为700bp，吞吐量为70Mb，运行时间为10至18小时。然而，罗氏决定减少对基因测序的关注，并在年底之前关闭了454个生命科学测序服务，因此罗氏 NGS 仪器将不会在本研究中进行更多讨论。

第三代测序

第二代测序方法需要对模板 DNA 进行 PCR 扩增，从而导致测序错误。如果在没有扩增的情况下基于单个分子进行测序，则可以克服这一限制。其次，产生结果所需的时间也很长，因为必须运行几个扫描和洗涤循环。由于每个核苷酸的添加，同步性也会丢失，这可能导致测序数据的噪声和 reads 的长度变短。单分子测序 (SMS) 是 3^rd^GS 方法，也被称为单模板方法。最著名的 SMS 方法是单分子实时测序 (SMRT)由太平洋生物科学公司 (PacBio)。该方法采用与第二代测序方法类似的合成化学测序方法，但需要较少的起始材料和对模板 DNA 进行 PCR 扩增，因此错误率低，读取长度长运行时间更短。SMRT 可以生成数万个碱基的长读;例如，最新的 PacBio 测序仪(2020年10月5日发布的Sequel IIe系统)可以在短短30小时内产生400万次读取，准确率超过99%。与 Nanopore 和 Illumina 相比，该系统具有更高的连续度(N50)、正确性(质量评分)和完整性(基因组大小)(表5)，而 PacBio HiFi测序的成本也与其竞争对手相比非常低(表6)。

与第二代测序相比，第三代测序具有以下几个优点;

更高的通量、直接检测单倍型、更长的读取长度、识别罕见变异的一致性准确性更高、完整的染色体相位、样本量小是第三代测序的显著特征，在临床诊断中具有重要意义。

第四代测序

第四代测序将纳米孔技术整合到 SMS 中。该技术实现实时测序，无需扩增和重复循环，消除合成和因此被称为 4G 测序。第4代，也叫原位测序技术，开辟了新的视野。DNA测序使鉴定序列成为可能固定细胞和组织中的核苷酸。它不同于其他测序生成方法有两种。首先, DNA Read 在样本上的空间分布所观察到的结果为在已知标记的基础上突出组织异质性提供了非常有用的信息。第二个区别是大量的细胞可以同时分析了。例如，健壮的单细胞开发了 RNA 测序方法，很便宜，并且能够对许多细胞进行测序，只需要很少的DNA起始量。缺点这种技术的特点是组织材料是由数千个细胞组成的，而对单个细胞进行测序则不是技术上和计算上都很简单。然而，它是预测原位测序将用于从传统 NGS 方法产生的数据中提取临床重要信息。靶向原位测序该方法可用于过滤经过验证的生物标记物直接在样品上，而非靶向技术可用于开发样品的分子谱，以便在分子水平上对疾病进行分类或满足患者。整合原位测序传统的NGS方法将加速开发这些方法，这些最终将成为必不可少的个性化医疗工具。纳米孔测序最受欢迎的 4^th^GS 平台，有能力识别分子(蛋白质，DNA, RNA等)，而他们传递通过在薄膜上的纳米级孔洞。在这种方法中，电场迫使单个分子通过直径为2纳米的纳米孔。由于孔非常薄，单链分子可以通过以牢固的线性顺序通过孔隙。当 DNA 分子通过时，会产生不同的电信号孔隙。最著名的纳米孔技术是牛津纳米孔技术。它是世界上最强大的国家之一序列技术，可以测序全基因组100万个碱基对可以很长时间读取和诊断疾病效率高，成本低。小黄人2014年发布，是纳米孔的第一个应用技术。其他高通量纳米孔器件来自牛津纳米孔技术公司有 GridION Mk1 和 PromethION 24/48。GridION mk1 有1-5个流动细胞生成 250gb 数据的能力。PromethION 24/48有1-48个流式电池，可产生高达 15tb 的数据。纳米孔测序分为三类。在1D的情况下，单链DNA被测序。在二维中，有两条线DNA的一部分被一个发夹状的结构束缚着获得一条DNA链的第一个序列，然后，第二链DNA被测序。这样，测序重复两次以提高碱基呼叫质量。1D2非常接近二维，但不需要保持发夹结构连接了两条DNA链。

测序平台的比较

所有测序仪器制造公司提供各种测序平台。一些生成小数据，而另一些在单次运行中生成大量数据。在这些测序器中，读取的长度和生成数据所消耗的时间也各不相同。表7给出了各种高性能测序仪的比较，表8给出了对测序的优缺点的分析。高性能测序仪的每小时输出分析表明:

Nanopore PromethION 优于所有测序仪，华大基因排名第二，Illumina排名第三。

快速发展的基因组测序方法大大降低了 NGS 数据的成本和时间生成和惊人的提高准确性和吞吐量通过使用非常少的 DNA 起始量。带来了这些技术领域的创新基因组学正在稳步发展，开辟了新的生命科学的各个领域。NGS系统大量减少了时间和实质精度的提高，NGS 方法能够应用于诊断、预后和预测变异。

促使人类基因组——走向个性化医疗。

另一方面，NGS 方法做到了可以进行大规模的“组学”研究，如基因组学、外显子组学、表观基因组学、宏基因组学和转录组学，这些研究提供了对基本基因组学和基因组学的深入应用于研究领域。

在SGS的技术中，Illumina已经提供大品种的台式及生产规模的 NGS 仪器，在客户中是最受欢迎的。这些仪器更经济并且是吞吐量最高的平台之一。离子激流仪器更多自动化的意义在于除了自动化之外提供 NGS 数据生成和分析自动化的准备工作。

一些研究表明离子流方法更适合法医 SNP 研究，虽然罗氏 454比 Illumina 有更好的通量。但是现在已经停产了。一些研究报道罗氏仪器是更容易出错，成本高，吞吐量低与其他NGS仪器相比。

GenapSys 重量轻、价格低、使用方便，利于基因组领域的初学者。该仪器的电子芯片具有不同数量的传感器:100万个传感器，1600万个传感器和1.44亿个传感器。这技术已经使音序器能够产生巨大的数据量范围。GenapSys有一千六百万传感器芯片每天可以产生1300万次读取。GenapSys 可用于鉴定病原体、sRNA、sWGS、靶向mRNA、SCP和基因编辑。QIAGEN 的 GeneReader 仅供合格人员使用过MB方法和 GeneReader本身培训的人员。给出了从样品制备到NGS数据生成的完整工作流程对结果的理解，采用“QCI分析”和“撤回”用于分析生物数据和变体调用及其注释。保证运行最终的质量以验证每个变量以最小化假阳性和假阴性指征。

Complete genomics成立于2006年，2013年被中国深圳华大收购，是全球领先的基因组服务机构之一。华大基因提供了一个研究、农业、医疗和环境应用。华大基因仪器生成高质量的WG和WE序列，覆盖范围为50倍。根据他们的说法，总共有2万多只人类基因组已经使用合适的仪器和程序进行了测序。

第三代测序技术有一些比SGS的优势，如这需要更少的DNA起始量，不需要PCR扩增模板DNA。这使得SMS能够生产更多产品在更短的时间内准确地读取长数据。最新的 PacBio 测序器(Sequel IIe系统)有能力产生在短短30小时内读取百万次，准确率超过99%。这与 Nanopore 和 Illumina 相比，PacBio HiFi 测序的成本也更高。TMS可以对数百万人进行测序单个分子甚至是FFPE样本。TMS在这方面比SGS有重要的改进，可以直接进行RNA测序。

纳米孔测序，即将纳米孔技术融入第三代测序技术，属于第四代测序的范畴。可以对固定细胞和组织进行实时测序，无需在合成阶段进行扩增和重复循环。最著名的纳米孔技术是ONT，可以对100万碱基对长的reads进行全基因组测序，非常高效且成本非常低的诊断疾病。MinION是纳米孔技术的首次应用。其他的是GridION Mk1和PromethION 24/48。GridION Mk1可生成250gb的数据，PromethION 24/48可生成15tb的数据。

NGS技术正在以惊人的速度发展。在不久的将来，NGS技术和仪器将在世界各地的临床和诊断实验室中发挥作用，帮助我们实现个性化医疗的梦想。此外，将会有非常好的便携式和全自动设备来生成NGS数据。因此，为了迎合未来的需求，应该开发算法和数据库来存储、处理、分析和可视化每个患者的数据，这可能对临床医生做出治疗决策有用。NGS方法的主要挑战包括缺乏管理质量、测序工作流程、测序数据处理和分析的标准化程序。

Reference

1. Pervez MT, Hasnain MJU, Abbas SH, Moustafa MF, Aslam N, Shah SSM. A Comprehensive Review of Performance of Next-Generation Sequencing Platforms. Biomed Res Int. 2022 Sep 29;2022:3457806. 

2. Yang A, Zhang W, Wang J, Yang K, Han Y, Zhang L. Review on the Application of Machine Learning Algorithms in the Sequence Data Mining of DNA. Front Bioeng Biotechnol. 2020 Sep 4;8:1032.

桓峰基因，铸造成功的您！

未来桓峰基因公众号将不间断的推出单细胞系列生信分析教程，

敬请期待！！

桓峰基因官网正式上线，请大家多多关注，还有很多不足之处，大家多多指正！http://www.kyohogene.com/

桓峰基因和投必得合作，文章润色优惠85折，需要文章润色的老师可以直接到网站输入领取桓峰基因专属优惠券码：KYOHOGENE，然后上传，付款时选择桓峰基因优惠券即可享受85折优惠哦！https://www.topeditsci.com/