NGS测序二三事

常见误区

在测序时，我们需要将DNA打断成fragment，构建library。这些fragment需要接上adaptor再扩增。illumina测序分为两种：single end 和 paired end。insertion 不是指R1 和 R2之间的unknown gap，而是adaptor间的序列。

而unknown gap被称为inner mate。我们不希望有很多的inner mate，所以需要制造短的fragment。目前的测序水平已经可以达到测通，这样合并R1 和 R2即可得到完整的fragment。虽然adaptor不会被测序，但如果fragment太短，被读通了，则另一端的adaptor会被测到。

一些计算

paired end测序数据量的计算：150（PE每条read150bp）x 2 x read数 = 数据量（每条lane120G）
测序深度：数据量大小/参考基因组大小。一个基因大小为2M，深度10X，则总数据量为20M。
覆盖度：测序获得序列站基因组比例。如覆盖度为99%，则1%为unknown gap。
ps：1个碱基=1bp，1kb=1024bp

duplication reads

duplicated reads是PCR对同一分子多次镜像复制的结果（起始，终止和其中的碱基都相同）。
duplication rate = 1- unique reads / total reads
无论有多少条，理论上都只有一条用于组装。

清洗数据后RPM的计算

RPM = total exon reads（某样本mapping到特定基因exon上所有reads ）/ mapped reads （某样本所有reads总和） (单位：million）
计算RPM的原因：直接用counts是有偏的，不同样本库大小，即总reads数是不同的。