StringTie v2.2.3安装与使用-生物信息学工具25

01 背景

StringTie：高效的转录组装和RNA-Seq数据定量工具

StringTie使用高效的算法从对齐到参考基因组的批量RNA-Seq读取中恢复转录结构并估计其丰度。它以坐标排序的SAM/BAM/CRAM格式输入剪接对齐，并生成一个GTF输出文件，该文件包含组装的转录结构及其估计的表达水平（FPKM/TPM和碱基覆盖值）。

和trinity assembly效果等同。均为转录本组装软件，使用一个即可~

Trinity安装与使用-Trinity-v2.15.1（bioinfomatics tools-006）

02 参考

https://github.com/gpertea/stringtie   #官网

https://ccb.jhu.edu/software/stringtie  ##官方网站

 03 安装

方法1
git clone https://github.com/gpertea/stringtie
cd stringtie
make release

在上述第一次运行make命令时，会下载并编译一些库依赖项，但之后的任何StringTie更新（使用git pull）应该会重建得更快。

要完成安装，可以将生成的stringtie二进制文件复制到选择的程序目录中（最好是当前shell的PATH中的一个目录）。

这样构建和安装StringTie在普通的Linux或Apple MacOS桌面上应该不到一分钟。

请注意，只运行make会生成一个不太优化的可执行文件，该文件适用于调试和运行时检查，但比使用上面指示的make release命令构建的优化版本慢得多。

方法2

wget -c https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/dl/stringtie-2.2.3.Linux_x86_64.tar.gz
tar -zxvf tab

04 使用及常用命令行

使用说明: ./stringtie -h

#### StringTie v2.2.3 用法:

stringtie <in.bam ..> [-G <guide_gff>] [-l <prefix>] [-o <out.gtf>] [-p <cpus>]
 [-v] [-a <min_anchor_len>] [-m <min_len>] [-j <min_anchor_cov>] [-f <min_iso>]
 [-c <min_bundle_cov>] [-g <bdist>] [-u] [-L] [-e] [--viral] [-E <err_margin>]
 [--ptf <f_tab>] [-x <seqid,..>] [-A <gene_abund.out>] [-h] {-B|-b <dir_path>}
 [--mix] [--conservative] [--rf] [--fr]

将RNA-Seq比对组装成潜在转录本。

#### 选项:
- --version: 打印版本号并退出
- --conservative: 保守的转录本组装，与`-t -c 1.5 -f 0.05`相同
- --mix: 提供短读和长读数据比对（长读比对必须是第二个BAM/CRAM输入文件）
- --rf: 假设链特异性文库fr-firststrand
- --fr: 假设链特异性文库fr-secondstrand
- -G: 用于指导组装过程的参考注释（GTF/GFF）
- --ptf: 从给定的4列特征文件<f_tab>加载点特征
- -o: 组装转录本GTF的输出路径/文件名（默认: stdout）
- -l: 输出转录本的名称前缀（默认: STRG）
- -f: 最小异构体分数（默认: 0.01）
- -L: 长读处理；同时强制`-s 1.5 -g 0`（默认: false）
- -R: 如果提供长读，只清理和合并读，不组装
- -m: 最小组装转录本长度（默认: 200）
- -a: 连接点的最小锚长度（默认: 10）
- -j: 最小连接点覆盖度（默认: 1）
- -t: 禁用根据覆盖度修剪预测的转录本（默认: 启用覆盖度修剪）
- -c: 考虑多外显子转录本的每bp最小覆盖度（默认: 1）
- -s: 考虑单外显子转录本的每bp最小覆盖度（默认: 4.75）
- -v: 详细模式（日志束处理细节）
- -g: 读映射之间允许的最大间隙（默认: 50）
- -M: 允许多命中读覆盖的束分数（默认: 1）
- -p: 使用的线程数（CPU）（默认: 1）
- -A: 基因丰度估计输出文件
- -E: 定义从长读可能出错的剪接位点周围的窗口，以查找正确的剪接位点（默认: 25）
- -B: 启用输出Ballgown表文件，这些文件将在输出GTF的相同目录中创建（需要`-G`，建议使用`-o`）
- -b: 启用输出Ballgown表文件，但这些文件将在给定的目录路径下创建
- -e: 仅估计给定参考转录本的丰度（需要`-G`）
- --viral: 仅适用于来自病毒数据的长读，其中剪接位点不遵循共识（默认: false）
- -x: 不组装给定参考序列上的任何转录本
- -u: 不进行多重映射修正（默认: 启用修正）
- -h: 打印此使用说明并退出
- --ref/--cram-ref: 用于CRAM输入的参考基因组FASTA文件

转录本合并模式:

stringtie --merge [Options] { gtf_list | strg1.gtf ...}

在此模式下，StringTie将从多个输入文件中组装转录本，生成一个统一的非冗余异构体集合。

可用选项:
- -G <guide_gff>: 合并中包含的参考注释（GTF/GFF3）
- -o <out_gtf>: 合并转录本GTF的输出文件名（默认: stdout）
- -m <min_len>: 包含在合并中的最小输入转录本长度（默认: 50）
- -c <min_cov>: 包含在合并中的最小输入转录本覆盖度（默认: 0）
- -F <min_fpkm>: 包含在合并中的最小输入转录本FPKM（默认: 1.0）
- -T <min_tpm>: 包含在合并中的最小输入转录本TPM（默认: 1.0）
- -f <min_iso>: 最小异构体分数（默认: 0.01）
- -g <gap_len>: 合并在一起的转录本之间的间隙（默认: 250）
- -i: 保留具有保留内含子的合并转录本；默认情况下，除非有强有力的证据，否则这些转录本不会被保留
- -l <label>: 输出转录本的名称前缀（默认: MSTRG）

输入文件
StringTie的输入是按坐标（基因组位置）排序的SAM、BAM或CRAM文件。该文件应包含剪接的RNA-seq读取对齐，例如由TopHat或HISAT2生成的对齐。TopHat输出已经排序。其他对齐生成的未排序的SAM或BAM文件应使用samtools程序进行排序：

samtools sort -o alns.sorted.bam alns.sam
上述命令生成的文件（alns.sorted.bam）可以用作StringTie的输入。

任何具有剪接对齐的SAM记录（即跨越至少一个连接点的读取对齐）都应具有XS标签以指示转录链，即产生此读取的RNA的基因组链。TopHat和HISAT2对齐已经包含此标签，但如果您使用其他读取映射器，则应检查是否也为剪接对齐记录包括此标签。STAR对齐器应使用选项--outSAMstrandField intronMotif运行以生成此标签。

对于使用minimap2和-ax splice选项对齐的长RNA-seq读取，不需要XS标签。minimap2将ts标签添加到剪接对齐以指示转录链（尽管与XS标签方式不同），如果XS标签丢失，StringTie也可以识别ts标签。因此，使用minimap2生成的长读取剪接对齐也可以由StringTie组装（使用-L选项或作为--mix选项的第二个输入文件）。

如上所述，对齐必须按坐标排序，然后才能用作StringTie的输入。

使用CRAM文件作为输入时，可以使用--ref（--cram-ref）选项提供原始参考基因组序列，作为多FASTA文件，其中包含对齐读取时使用的相同染色体序列。这是可选的，但建议这样做，因为StringTie可以更好地估计某些剪接对齐的质量（例如注意到连接点周围的错配），并且在某些CRAM文件的情况下，只有提供参考基因组序列时才能检索这些数据。

参考转录本（指南）
可以使用-G选项向StringTie提供GTF或GFF3格式的参考注释文件，该文件可以用作组装过程的“指南”。

使用-e选项（即仅表达估计）时，此选项是必需的，在这种情况下，StringTie不会尝试组装读取对齐，而是仅估计此文件中提供的所有转录本的表达水平。

注意，当读取完全覆盖参考转录本时，参考注释文件中的原始转录本ID将显示在StringTie的输出记录中的reference_id GTF属性中。缺少此reference_id属性的输出转录本可以视为相对于给定参考注释的“新”转录结构。

运行StringTie
默认用法的通用命令行格式如下：

stringtie [-o <output.gtf>] [other_options] <read_alignments.bam>

程序的主要输入（<read_alignments.bam>）必须是按基因组位置排序的SAM、BAM或CRAM文件（例如由TopHat生成的accepted_hits.bam文件，或用samtools sort排序的HISAT2输出）。

主要输出是一个GTF文件，其中包含StringTie从读取对齐数据中组装的转录结构。输出文件的名称应使用-o选项指定。如果不使用此-o选项，组装的转录本的输出GTF将打印到标准输出（并且可以使用>输出重定向操作符捕获到文件中）。

05 参考文献

Shumate A, Wong B, Pertea G, Pertea M Improved transcriptome assembly using a hybrid of long and short reads with StringTie, PLOS Computational Biology 18, 6 (2022), doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009730

Kovaka S, Zimin AV, Pertea GM, Razaghi R, Salzberg SL, Pertea M Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2, Genome Biology 20, 278 (2019), doi:10.1186/s13059-019-1910-1

Pertea M, Kim D, Pertea GM, Leek JT, Salzberg SL Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown, Nature Protocols 11, 1650-1667 (2016), doi:10.1038/nprot.2016.095

Pertea M, Pertea GM, Antonescu CM, Chang TC, Mendell JT & Salzberg SL StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads, Nature Biotechnology 2015, doi:10.1038/nbt.3122