fastqc帮助

最新推荐文章于 2024-05-08 09:33:13 发布

weixin_45066533

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文章标签： python 开发语言

本文链接：https://blog.csdn.net/weixin_45066533/article/details/129965362

版权

基础操作

标题评估结果

	FastQC中的分析是通过一系列分析模块来完成的。主交互显示的左侧或HTML报告的顶部显示了已运行模块的摘要，并快速评估模块的结果是否完全正常(绿色标记)、轻微异常(橙色三角形)或非常异常(红色十字)。 
	重要的是要强调，尽管分析结果似乎给出了一个通过/失败的结果，但这些评估必须在您对库的期望上下文中进行。FastQC所关注的“正常”样本是随机和多样化的。一些实验可能会产生以特定方式有偏见的库。因此，您应该将总结评估视为您应该集中注意力的指针，并理解为什么您的库可能看起来不随机和多样化。关于如何解释每个模块的输出的具体指导可以在帮助的模块部分中找到。

保存报告

	除了提供交互式报告外，FastQC还可以选择创建该报告的HTML版本，以获得更永久的记录。这个HTML报告也可以在非交互模式下运行FastQC直接生成。
	要创建一个报告，只需选择File&gt;从主菜单保存报告。默认情况下，将使用fastq文件的名称创建报告，并将_fastqc.html附加到末尾。在选择菜单选项时，将为任何活动的文件选项卡创建报告。
	保存的HTML文件是一个包含所有图形的自包含文档，因此您可以分发这个单独的文件。HTML文件旁边是一个zip文件(与HTML文件同名，但在末尾添加了.zip)。该文件包含来自报告的图表作为单独的文件，但也包含数据文件，这些文件被设计为易于解析，以允许对构建QC报告的原始数据进行更详细和自动化的评估

模块分析

基本统计信息

总结

	Basic Statistics模块为分析的文件生成一些简单的组合统计信息。
	文件名:被分析的文件的原始文件名
	文件类型:表示文件似乎包含实际的基本调用还是必须转换为基本调用的色彩空间数据
	Encoding:表示在此文件中找到了质量值的哪种ASCIl编码。
	总序列:处理的序列总数的计数。报告了两个值，实际值和估计值。现在这些都是一样的。在未来，它可能只分析序列的一个子集并估计总数，以加快分析速度，但由于我们发现有问题的序列不是均匀分布在一个文件中，所以我们暂时禁用了这一点。
	过滤序列:如果在Casava模式下运行，标记为过滤的序列将从所有分析中删除。删除的这些序列的数量将在这里报告。上面的总序列计数不包括这些过滤后的序列，而是实际用于其余分析的序列数。
	序列长度:提供集合中最短和最长序列的长度。如果所有序列的长度相同，则只报告一个值。
	%GC:所有序列中所有碱基的总GC %

警告

	基本统计从不引发警告。

失败

	基本统计从不引发错误。

警告的常见原因

	此模块从不引发警告或错误

每个碱基序列质量

总结

	对于每个位置绘制BoxWhisker类型的图形。剧情的要素如下:
	中间的红线是中间值
	黄色方框表示四分位范围(25-75%)
	上面和下面的胡须分别代表10%和90%
	蓝线代表平均质量
	图中的y轴表示质量分数。分数越高，基础呼叫越好。图的背景将y轴划分为质量非常好的呼叫(绿色)、质量尚可的呼叫(橙色)和质量较差的呼叫(红色)。在大多数平台上，随着运行的进行，调用的质量会下降，所以在读取结束时，经常会看到基本调用落入橙色区域。
	值得一提的是，在FastQ文件中编码质量分数的方法有很多种。FastQC尝试自动确定使用了哪种编码方法，但在一些非常有限的数据集中，它可能会猜测错误(具有讽刺意味的是，只有当您的数据普遍非常好!)图的标题将描述FastQC认为您的文件使用的编码。
	如果您的输入是一个没有记录质量分数的BAM/SAM文件，则此模块的结果将不会显示。

警告

	如果任何基数的下四分位数小于10，或任何基数的中位数小于25，将发出警告。

失败

	如果任何基数的下四分位数小于5或任何基数的中位数小于20，此模块将引发失败。

警告的常见原因

	此模块中出现警告和失败的最常见原因是在长时间运行期间质量普遍下降。一般来说，序列化学反应会随着读取长度的增加而降低，对于长期运行，你可能会发现运行的总体质量下降到触发警告或错误的水平。
	如果库的质量下降到较低的水平，那么最常见的补救措施是执行质量修剪，即根据平均质量截断读取。对于大多数发生了这种降级的库，您经常会同时遇到适配器通读的问题，因此通常会采用适配器和质量调整相结合的步骤。
	另一种可能性是，由于运行早期的短时间质量损失而触发警告/错误，然后恢复以生成稍后的高质量序列。如果运行过程中出现短暂问题(例如气泡通过流池)，就会发生这种情况。通过查看每个贴图的质量图(如果适用于您的平台)，通常可以看到这种类型的错误。在这些情况下，修剪是不可取的，因为它将删除以后的良好序列，但您可能要考虑在后续映射或组装期间屏蔽基。
	如果你的库有不同长度的读取，那么你会发现这个模块会触发一个警告或错误，因为给定的基本范围的覆盖率非常低。在执行任何操作之前，通过查看序列长度分布模块的结果，检查有多少序列负责触发错误。

每个序列的质量分数

总结

	每个序列质量评分报告允许您查看序列的子集是否具有普遍的低质量值。通常情况下，一个序列子集的质量普遍较差，通常是因为它们成像很差(在视野的边缘等)，然而这些应该只代表总序列的一小部分。

在这里插入图片描述
如果在一次测试中，有相当一部分序列的整体质量较低，那么这可能表明存在某种系统性问题——可能只是部分测试(例如流池的一端)。
如果您的输入是一个没有记录质量分数的BAM/SAM文件，则此模块的结果将不会显示。

警告

	如果最常观察到的平均质量低于27，则提出警告-这相当于0.2%的错误率。

失败

	如果最常观察到的平均质量低于20，则会引发错误——这相当于1%6的错误率。

警告的常见原因

	这个模块通常是相当健壮的，这里的错误通常表示运行中质量的总体损失。从长期来看，这可以通过质量调整来缓解。如果出现双模态或复杂分布，则应根据每个瓦的质量(如果可用)对结果进行评估，因为这可能表明序列子集质量损失的原因。

每个碱基序列内容

总结

	每个碱基序列内容绘制出文件中四种正常DNA碱基中每种碱基位置的比例。

在这里插入图片描述
在随机库中，您会期望序列运行的不同碱基之间几乎没有差异，因此图中的线应该彼此平行运行。每个碱基的相对数量应该反映出你基因组中这些碱基的总量，但在任何情况下，它们之间都不应该严重失衡。
值得注意的是，某些类型的库总是会产生有偏差的序列组合，通常是在读取的开始。使用随机六聚体启动产生的文库(包括几乎所有RNA-Seq文库)和使用转座酶碎片化的文库在读取开始的位置继承了固有的偏向。这种偏差与绝对序列无关，而是在读取的5’端提供了大量不同K-mers的富集。虽然这是一个真正的技术偏差，但在大多数情况下，它不是可以通过修剪和修改来纠正的似乎不会对下游分析产生不利影响。然而，它将在此模块中产生警告或错误。

警告

	在任何位置，如果a和T或G和C之间的差异大于10%，该模块就会发出警告。

失败

	在任何位置，如果A与T或G与C之间的差异大于20%6，则该模块将失败。

警告的常见原因

	有许多常见的场景会从此模块发出警告或错误。
	1. 过度表示序列:如果有任何证据表明样本中存在过度表示的序列，如适配器二聚体或rRNA，那么这些序列可能会使整体组成产生偏差，其序列将从该图中出现。
	2. 偏向碎片化:任何基于随机六聚体连接或通过tagentation生成的库理论上应该在整个序列中具有良好的多样性，但经验表明，这些库总是在每次运行的前12bp左右有选择偏向。这是由于随机引物的偏误选择，但不代表任何单独偏误的序列。由于这种偏差，几乎所有RNA-Seq库都无法通过此模块，但这不是一个可以通过处理解决的问题，而且它似乎不会对测量表达的能力产生不利影响。
	3.有偏见的组合库:有些库在序列组合方面天生就有偏见。最明显的例子是一个用亚硫酸氢钠处理过的文库，它会将大部分胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，这意味着碱基组成几乎没有胞嘧啶，因此会引发错误，尽管这对这种类型的文库来说是完全正常的
	4. 如果你正在分析一个已经被适配器修剪过的库，那么你会很自然地在读取的末尾引入一个组合偏差，因为恰好匹配短段适配器的序列被删除，只留下不匹配的序列。因此，在经过积极修整的库的末尾，构成的突然偏差很可能是假的。

每条序列的CG含量

总结

	该模块测量文件中每个序列的整个长度的GC内容，并将其与建模的GC内容正态分布进行比较。

在这里插入图片描述
在一个正常的随机库中，你会期望看到一个大致正态分布的GC含量，其中中心峰值对应于底层基因组的总体GC含量。由于我们不知道基因组的GC含量，因此模态GC含量是根据观测数据计算出来的，并用于构建参考分布。
形状异常的分布可能表示一个受污染的库或其他类型的偏置子集。移位的正态分布表明存在某种与基准位置无关的系统偏差。如果存在系统偏差，从而产生移位的正态分布，那么模块就不会将其标记为错误，因为它不知道你基因组的GC含量应该是多少。

警告

	如果偏离正态分布的偏差之和超过读数的15%，则提出警告。

失败

	如果偏离正态分布的偏差之和超过读的30%，此模块将指示故障。

警告的常见原因

	此模块中的警告通常表示库存在问题。平滑分布上的尖峰通常是特定污染物(例如适配器二聚体)的结果。这可能会被overrepresentation sequences模块捕获。更宽的山峰可能代表了不同物种的污染。

每个碱基位置上的N含量

总结

	如果一个定序器不能够有足够的信心做出碱基识别那么它通常将该位置的识别用N来代替通常的碱基识别。
	这个模块绘制出每个碱基位置上识别为N的比例。

在这里插入图片描述
在序列中出现n的比例非常低，尤其是在序列的末尾，这并不罕见。然而，如果这个比例超过几个百分点，就表明分析管道无法很好地解释数据，从而做出有效的基础调用。

警告

	如果任何位置显示N含量为>5%，该模块将发出警告。

失败

	如果任何位置显示N含量为>20%，此模块将引发错误。

警告的常见原因

	包含大量n的最常见原因是质量的普遍损失，因此该模块的结果应与各种质量模块的结果一致进行评估。您应该检查特定bin的覆盖范围，因为本分析中的最后一个bin可能包含很少的序列，在这种情况下可能会过早触发错误。
	另一种常见的情况是，在一般质量良好的背景下，在库早期的少数位置出现了高比例的N。当库中有非常偏向的序列组合时，就会发生这种偏差，以至于基调用者可能会感到困惑并做出糟糕的调用。在查看每个碱基序列内容结果时，这种类型的问题将很明显。

序列长度分布

总结

	一些高通量测序器生成相同长度的序列片段，但其他的可以包含不同长度的读取。即使在等长库中，一些管道也会对序列进行修剪，以从末尾删除质量较差的基类调用。
	该模块生成一个图表，显示所分析的文件中片段大小的分布。

在这里插入图片描述
在许多情况下，这将产生一个简单的图形，只显示一个大小的峰值，但对于可变长度的FastQ文件，这将显示每个不同大小的序列片段的相对数量。

警告

	如果所有序列的长度不相同，此模块将发出警告。

失败

	如果任何序列的长度为零，此模块将引发错误。

警告的常见原因

	对于某些测序平台，读取长度不同是完全正常的，因此可以忽略这里的警告。

重复序列

总结

	在一个多样化的库中，大多数序列只会在最终集中出现一次。低水平的重复可能表明目标序列的覆盖率很高，但高水平的重复更可能表明某种富集偏倚(如PCR扩增)。
	这个模块计算库中每个序列的复制程度，并创建一个图表，显示具有不同复制程度的序列的相对数量。

在这里插入图片描述
为了减少这个模块的内存需求，只分析每个文件中第一个出现在前100,000个序列中的序列，但这应该足以对整个文件中的复制水平有一个良好的印象。每个序列都被跟踪到文件的末尾，以给出总体复制级别的代表性计数。为了减少最终图中的信息量，任何重复超过10个的序列都被放入分组的箱子中，以便在不显示每个单独的重复值的情况下清晰地显示整体复制水平。
由于重复检测需要在整个序列的长度上进行精确的序列匹配，因此为了分析的目的，任何长度超过75bp的读取都被截断为50bp。即便如此，较长的读取更有可能包含测序错误，这将人为地增加观察到的多样性，并倾向于不充分表示高度重复的序列。
该图显示了由每个不同复制级别箱中的序列组成的库的比例。情节上有两条线。蓝线取完整的序列集，并显示其复制级别是如何分布的。在红色的图中，序列被去重复，所显示的比例是来自原始数据中不同重复级别的去重复集的比例。
在一个适当多样化的库中，大多数序列应该落在图的最左边的红色和蓝色线中。一般的富集水平，表明库中广泛的过测序将倾向于使线变平，降低低端，一般提高其他类别。更具体的子集富集，或低复杂性污染物的存在，将倾向于在图的右侧产生尖峰。这些高复制峰值通常出现在蓝色轨迹中，因为它们在原始库中占很大比例，但通常消失在红色轨迹中，因为它们在重复数据删除集中所占的比例很小。如果蓝色痕迹中持续出现峰值，则表明存在大量不同的高度重复序列，这可能表明污染物集或非常严重的技术重复。
如果库要重复数据删除，该模块还计算预期的总体序列损失。这一标题数字显示在图表的顶部，合理地显示了潜在的总体损失水平。

警告

	如果非唯一序列占总数的20%以上，该模块将发出警告。

失败

	如果非唯一序列占总数的50%以上，该模块将报错。

警告的常见原因

	这个模块的基本假设是一个多样化的非丰富的库。与此假设的任何偏差都会自然地产生重复，并可能导致该模块的警告或错误。
	一般来说，文库中有两种潜在的副本类型，一种是由PCR人工产物产生的技术副本，另一种是自然碰撞产生的生物副本相同的序列是随机选择的。从序列级别，没有办法区分这两种类型，在这里两者都将被报告为重复。
	此模块中的警告或错误只是说明您已经耗尽了至少部分库中的多样性，并且正在重新排序相同的序列。在一个本应多样化的库中，这将表明多样性已经部分或完全耗尽，因此您正在浪费隔离能力。然而，在某些库类型中，您自然会倾向于对库的某些部分进行过序处理，从而产生重复，并因此期望从该模块中看到警告或错误。
	在RNA-Seq文库中，来自不同转录本的序列将在起始种群中以截然不同的水平出现。为了能够观察到低表达的转录本，因此对高表达的转录本进行大过序是很常见的，这可能会产生大量的重复。这将导致在测试中出现较高的整体复制，并且通常会在较高的复制箱中产生峰值。这种复制将来自物理连接的区域，对特定基因组区域的重复分布的检查将允许区分过度测序和一般技术复制，但从原始fastq文件中不可能进行这些区分。在高度丰富的ChiP-Seq库中也会出现类似的情况，尽管那里的重复不那么明显。最后，如果你有一个序列起始点受到限制的库(例如，一个围绕限制位点构建的库，或者一个未碎片化的小RNA库)，那么受限制的起始位点将产生巨大的重复水平，这不应该被视为一个问题，也不应该被重复数据删除。在这些类型的图书馆中，您应该考虑使用随机条形码等系统来区分技术副本和生物副本。

过表达序列

总结

	一个正常的高通量库将包含一组不同的序列，没有单个序列占整个序列的很小一部分。发现一个序列在集合中被过度代表，要么意味着它具有高度的生物学意义，要么表明文库被污染了，要么没有你预期的那么多样化。这个模块列出了所有占总数0.1%以上的序列。
	为了节省内存，只有出现在前100,000个序列中的序列才会被跟踪到文件的末尾。因此，这个模块可能会错过一个过度表示但由于某种原因没有出现在文件开头的序列。
	对于每个被过度表示的序列，程序将在常见污染物数据库中寻找匹配，并报告它找到的最佳匹配。命中必须至少有20bp的长度，并且不超过1个不匹配。找到一个目标并不一定意味着这就是污染的来源，但可能会给你指明正确的方向。值得指出的是，许多适配器序列彼此非常相似，所以您可能会得到一个命中报告，它在技术上是不正确的，但它与实际匹配的序列非常相似。
	因为重复检测需要在整个序列的长度上进行精确的序列匹配，为了分析的目的，任何长度超过75bp的读取都被截断为50bp。即便如此，较长的读取更有可能包含测序错误，这将人为地增加观察到的多样性，并倾向于不充分表示高度重复的序列。

警告

	如果发现任何序列占总数的o .1%以上，此模块将发出警告。

失败

	如果发现任何序列占总数的1%以上，该模块将发出错误。

警告的常见原因

	当用于分析小的RNA文库时，该模块通常会被触发，其中序列不受随机片段的影响，并且相同的序列可能自然地存在于文库的很大比例中。

接头含量

总结

	Kmer Content模块将对库中的所有Kmer进行一般性分析，以找出那些在您的阅读长度中没有覆盖的Kmer。这可以在库中找到许多不同的偏差来源，其中包括在序列末尾建立的通读适配器序列。
	然而，您可能会发现库中任何过度表示的序列(例如适配器二聚体)的存在将导致Kmer图被这些序列所包含的Kmer所支配，并且并不总是容易看到是否存在您可能感兴趣的其他偏差。
	你可能想要分析的一类明显的序列是适配器序列。了解您的库是否包含大量的适配器，以便能够评估是否需要调整适配器，这是很有用的。虽然Kmer分析理论上可以发现这种污染，但并不总是清楚的。因此，本模块对一组单独定义的kmer进行特定搜索，并将为您提供包含这些kmer的库的总比例视图。将始终为适配器配置文件中出现的所有序列生成结果跟踪，以便您可以看到库的适配器内容，即使它很低。
	图表本身显示了在每个位置看到每个适配器序列的库所占比例的累计百分比计数。一旦在读取中看到一个序列，它就会被计算为一直存在到读取结束，所以你看到的百分比只会随着读取长度的增加而增加。

警告

	如果任何序列出现在所有读取的5%以上，该模块将发出警告。

失败

	如果任何序列出现的次数超过所有读取次数的10%，该模块将发出警告。

警告的常见原因

	任何库如果插入大小的合理比例小于读取长度，都将触发此模块。这并不表明存在问题——只是在进行任何下游分析之前，需要对序列进行适配器修剪。

Kmer含量

总结

	对过度表示的序列的分析将发现任何完全重复的序列的增加，但有一个不同的问题子集，在那里它将不起作用。
	如果你有很长的序列，而序列质量很差，那么随机测序错误将大大减少精确重复序列的计数。
	如果你有一个部分序列出现在你的序列中的不同地方，那么这将不会被每个碱基内容图或重复序列分析看到。				 Kmer模块开始于这样一个假设:在一个不同的库中，任何序列的小片段在其外观上都不应该有位置偏差。可能有生物学原因导致某些Kmers总体上富集或耗尽，但这些偏差应该平等地影响序列中的所有位置。因此，本模块测量库中每个位置上的每个7-mer的数量，然后使用二项式测试来寻找所有位置上均匀覆盖的显著偏差。报告任何具有位置偏向富集的Kmers。前6个最偏向的Kmer额外绘制，以显示他们的分布。

在这里插入图片描述
为了让这个模块在合理的时间内运行，只分析了整个库的2%，并将结果外推到库的其余部分。在此分析中，长度超过500bp的序列被截断为500bp。

警告

	如果任何k-mer与二项p值o.o1不平衡，该模块将发出警告。

失败

	如果任何k-mer与二项p值10^-5不平衡，该模块将发出警告。

警告的常见原因

	任何单独的超表示序列，即使没有出现在足够高的阈值以触发超表示序列模块，也会导致这些序列中的Kmers在该模块中高度富集。这些通常表现为序列中单点的富集尖峰，而不是渐进式或广泛富集。来自随机引物的库几乎总是在库开始时显示克默偏差，这是由于可能的随机引物的不完全抽样。

每个tile序列质量

总结

	如果您使用的是保留原始序列标识符的lumina库，则此图只会出现在分析结果中。在这些代码中编码的是流单元瓦，每个读取都来自于此。的
	图形允许您查看所有基础中每个瓦的质量分数，以查看是否仅与流单元的一个部分相关的质量损失。该图显示了每个瓦片与平均质量的偏差。颜色在冷到热的范围内，冷的颜色是质量在运行中处于或高于平均水平的位置，而热的颜色表明瓷砖的质量比其他瓷砖的质量差。在下面的例子中，您可以看到某些瓷砖始终表现出较差的质量。一个好的地块应该是蓝色的。

在这里插入图片描述
在图中看到警告或错误的原因可能是暂时性的问题，如气泡穿过流池，也可能是永久性的问题，如流池上的污迹或流池通道内的碎片。
每个tail测序情况，横轴表示碱基位置，纵轴表示tail的index编号，这个图主要是为了防止在测序过程中某些tail受到不可控因素的影响而出现测序质量偏低，蓝色表示测序质量很高，暖色表示测序质量不高。当某些tail出现暖色，在后续的分析种把该tail测序结果全部去除

警告

	该模块将发出警告，如果任何瓷砖显示的平均Phred得分比所有瓷砖的平均值低2以上。

失败

	如果任何贴图显示的平均Phred分数比所有贴图的平均值低5以上，该模块将引发错误。

警告的常见原因

	虽然此模块中的警告可以由个别特定事件触发，但我们也观察到，当流单元通常超载时，归因于瓷砖的phred分数也会出现更大的变化。在这种情况下，事件出现在整个流池中，而不是局限于特定的区域或周期范围。我们通常会忽略仅在1或2个循环中轻微影响少量瓷砖的错误，但会追求在分数上表现出高偏差或持续几个循环的更大影响。

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引用文本

H₂O is是液体。

2¹⁰ 运算结果是 1024.

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链接: link.

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带尺寸的图片:

居中的图片: Alt

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如何插入一段漂亮的代码片

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// An highlighted block
var foo = 'bar';

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项目
- 项目
  - 项目

项目1
项目2
项目3

计划任务
完成任务

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一个简单的表格是这么创建的：

项目	Value
电脑	$1600
手机	$12
导管	$1

设定内容居中、居左、居右

使用:---------:居中
使用:----------居左
使用----------:居右

第一列	第二列	第三列
第一列文本居中	第二列文本居右	第三列文本居左

SmartyPants

SmartyPants将ASCII标点字符转换为“智能”印刷标点HTML实体。例如：

TYPE	ASCII	HTML
Single backticks	`'Isn't this fun?'`	‘Isn’t this fun?’
Quotes	`"Isn't this fun?"`	“Isn’t this fun?”
Dashes	`-- is en-dash, --- is em-dash`	– is en-dash, — is em-dash

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Markdown

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Authors

John

Luke

如何创建一个注脚

一个具有注脚的文本。²

注释也是必不可少的

Markdown将文本转换为 HTML。

KaTeX数学公式

您可以使用渲染LaTeX数学表达式 KaTeX:

Gamma公式展示 $\Gamma(n) = (n-1)!\quad\forall n\in\mathbb N$ 是通过欧拉积分

$\Gamma(z) = \int_0^\infty t^{z-1}e^{-t}dt\,.$

你可以找到更多关于的信息 LaTeX 数学表达式here.

新的甘特图功能，丰富你的文章

关于 甘特图 语法，参考这儿,

UML 图表

可以使用UML图表进行渲染。 Mermaid. 例如下面产生的一个序列图：

这将产生一个流程图。:

关于 Mermaid 语法，参考这儿,

FLowchart流程图

我们依旧会支持flowchart的流程图：

关于 Flowchart流程图 语法，参考这儿.

导出与导入

导出

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