免疫组库数据分析（三）：免疫组库数据可视化

免疫组库数据分析（三）：免疫组库数据可视化

前言

在系列文章第二篇《免疫组库数据分析（二）：Excel 分析免疫组库数据》中，分析了免疫组库中V基因、J基因、V-J组合的使用频率。在氨基酸水平，分析了CDR3 的氨基酸的长度分布以及20种氨基酸的使用频率；在免疫组库多样性方面，分析了4种不同的多样性指数。

本篇将利用作图软件Graphpad prism 8以及Excel 将上述分析的数据进行可视化，此外利用在线工具分析CDR3 氨基酸保守性，或者两组样本CDR3长度的氨基酸差异。

数据可视化

1. 免疫组库V基因与J基因使用频率：柱状图

打开作图软件Graphpad prism 8中，选择Grouped （组）表格，然后TRBV基因的使用频率百分比数据复制到表格中，A组输入Clonecounts数据，B组输入clonetype数据（为了对比两者计算差异，而在真实实验中，通常是样品之间的对比，可以选择Clonecounts水平，也可以选择clonetype水平）

如下图所示，柱状图表示免疫组库V基因使用频率，两种计算方式得到的V基因使用频率差异不大。

​ 按照相同方法可绘制 J基因使用频率使用频率的柱状图，过程不表。

2. 免疫组库VJ 组合的使用频率：热图以及三维柱状图

免疫组库克隆子V-J组合情况，通过构建矩阵，分析任意V基因与J基因组合的使用频率分布。在Excel表格中，SUMIFS、COUNTIFS函数计算得到Clonecounts、Clonetype水平V-J组合使用频率。在可视化过程中，利用Graphpad prism8 里面 grouped 构建表格。

如下图可是，行名为V基因名，列名为J基因名，本次作图将两种计算方式得到的V-J组合频率数据放在同一张表格里面用于对比，中间空一列，并且第二组数据只输入列名。在实际过程中，可以是两个不同样本数据的对比。

作图选择Grouped 中Heatmap热图 选项。

热图选项中，双击图片，在【Color mapping】 选项中，Double gradient 选择三色，蓝-黄-红色，调整取值范围；off the map 取消X标记；在【Lables]选项中，Row Labels ,Columm Labels 选择Row titles/Columm titles,调整字体大小。最终热图效果如下：

而在Excel 中也可以实现矩阵热图的绘制，将两组数据复制在同一表格中，第一列为行名，第一行为列名，组与组之间至少空一列。在电子表格点击【插入】-【柱状图】-【三维圆柱图】即可实现三维矩阵图。

引申思考：

三维柱图来表示免疫组库V-J组合的使用频率分布，是否可以联想到两片森林，如果这是实验组与对照组的比较，是否联想到多样性的比较呢？

3、CDR3 的氨基酸的长度分布：柱状图或者散点图。

无论是Excel 还是Graphpad prism 都能绘制柱状图与散点图。本文在Graphpad prism 上作图为例。

分别选择Grouped、XY模式，选择10-20aa范围的相对使用频率数据，作图如下：

4、20种氨基酸的使用频率

通常CDR3氨基酸的疏水性与免疫反应相关，根据IMGT网站上氨基酸的性质，按照氨基酸的疏水性排列（如下图），然后通过SUMIF函数，按照新的氨基酸排序方式计算每一种氨基酸的使用频率。如氨基酸I的使用频率利用公式=SUMIF($AY$1:$BR$1,AY5,$AY$3:$BR$3)

最终CDR3氨基酸使用频率柱状图如下：

5.免疫组库CDR3多样性指数

免疫组库CDR3多样性采用Shannon‘s index、Margalef‘s index、Berger-Parker‘s index、Simpson’s Reciprocal Index,并模拟真实实验，设置对照与实验组，如下图

6、CDR3 氨基酸保守性

根据CDR3 氨基酸长度使用频率，给出每种TCR最高使用频率的氨基酸长度，提取氨基酸序列，使用在线工具Weblogo3（http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi）分别分析不同TCR的CDR3的氨基酸保守序列。本文使用TCRB免疫组库数据中CDR3氨基酸序列进行分析。

登录Weblogo3网站，筛选使用频率最高的CDR3氨基酸长度（14aa)，将其序列直接复制粘贴到输入框。直接点击Create WEblogo按钮，或者调整对应参数后，生成相应格式（如JPEG、TIFF、PDF）的图片。

14个氨基酸长度的CDR3氨基酸保守性分析结果如下：

同理也可以得到13，15个氨基酸长度CDR3氨基酸保守Motif。

7、CDR3 氨基酸多样性分析：

使用在线工具 Two Sample Logo，计算两组相同CDR3长度的氨基酸差异，根据t检验（p<0.05）计算显著性差异氨基酸位点。网站图示如下：

本文模拟了对照组与实验组数据，选取了14个氨基酸长度的CDR3序列，结果如下：

总结

本文介绍了绘制不同免疫组库数据图的方法，如免疫组库中V基因、J基因使用频率的柱状图、V-J组合的使用频率r热图、三维圆柱图；CDR3 的氨基酸的长度分布散点曲线图、20种氨基酸的使用频率柱状图；免疫组库多样性指数散点图。此外利用在线工具分析CDR3 氨基酸保守性MOTIF图，两组样本CDR3长度的氨基酸差异MOTIF图。利用Graphpad 软件Layout功能将所做图片进行整合，外来图片通过点击右键-【import picture】实现。最终样图如下。

拓展资料

在线网站

Weblogo3（http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi）

IMGT-氨基酸性质(http://www.imgt.org/IMGTeducation/Aide-memoire/_UK/aminoacids/IMGTclasses.html）

Two Sample Logo(http://www.twosamplelogo.org）

后记

终于把将博士期间一点小工作收获进行了总结，
了却一件小心愿。
在家完成系列文章，
此后将在新城市开始新的生活，工作。
而在撰写过程中，女儿诞生了，
因此此系列文章完成以庆祝女儿洛洛的诞生。
                              2020年6月
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