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上篇主要简单介绍了RNA-seq流程及简单的概念，这篇博文主要讲获取数据后的一些操作。
大概流程为：数据预处理、序列比对、基因表达定量、差异表达分析、功能注释和富集分析等。
一、软件安装
1.常规软件安装
以下是可能用到的一些软件，由于测序数据量比较大，有条件的可以使用服务器来操作，为了便于管理，建议使用conda安装和管理软件。可以参考原创10000+生信教程大神给你的RNA实战视频演练
（1）SRA-tools：一组用于访问和处理Sequence Read Archive (SRA) 数据的命令行工具。内含工具主要包括：prefetch：用于从 SRA 数据库下载测序数据。fastq-dump：用于将下载的 SRA 文件转换为常见的 FASTQ 格式，以便进行进一步的分析。fasterq-dump：fastq-dump 的改进版本，速度更快，适合处理大数据集。sam-dump：用于将 SRA 数据转换为 SAM 格式（测序比对格式）。vdb-config：配置 SRA 工具的参数，比如下载路径、缓存大小等。
（2）FastQC：用于评估高通量测序数据的质量。
（3）Trim Galore：用于剪切测序数据中的低质量序列和接头序列。
（4）HISAT2：用于将RNA-Seq数据比对到参考基因组上。
（5）Subread：用于比对和量化RNA-Seq、DNA-Seq等高通量测序数据。
（6）MultiQC：用于整合并展示多个质控工具的结果。
（7）Samtools：用于处理比对后的SAM/BAM/CRAM文件。
（8）Salmon：用于RNA-Seq数据的转录本定量分析。
（9）Fastp：高效的测序数据质控和剪切工具。
（10）aspera CLI: IBM Aspera提供的命令行工具，用于通过Aspera的高速文件传输协议（Aspera FASP）传输大型文件和数据集。
安装好conda后，把fastqc换成需要的软件即可。
conda install -y fastqc2.创建工作目录
wkd="/xxx/data" # 工作目录二、数据预处理
1.sra文件下载及格式转变。
首先设置工作目录及环境
mkdir -p ~/xxx/xxx
cd ~/xxx/xxx
mkdir -p rawdata fastq qc trim_galore fastp hisat2 featureCounts#此处根据需要创建第一种：测序公司的文件。
第二种：可以先在把数据下载在本地，再上传（如果数据量比较大的不推荐这种方法），
第三种：通过prefetch下载SRA数据，新建一个包含SRR号码的文档（一个号码占据一行）
#下载单个数据
prefetch SRRxxx -O ./rawdata #-O . 指定到当前路径；
#下载多个数据，SRR号码保存在文档里，每行一个
cat SRR_Acc_List.txt | while read id; do (prefetch ${id} );done第四种：通过ascp（Aspera Connect）下载，NCBI提供的一种工具。Downloads and Documentation - IBM Aspera，感兴趣的可以试试。
格式转变： sra转为fastq
fastq-dump *.sra #格式转换这两步也可以合并，代码如下
#!/bin/bash
# 1. 批量下载 .sra 文件
cat SRR_Acc_List.txt | while read id; do
prefetch ${id}
done
# 2. 批量转 .fastq.gz
cat SRR_Acc_List.txt | while read id; do
fasterq-dump --split-3 ${id}/${id}.sra && gzip ${id}_*.fastq
done
# 3. 清理临时文件
rm -rf SRR*/ # 删除 prefetch 生成的临时目录Fastq格式是一种基于文本的存储生物序列和对应碱基（或氨基酸）质量的文件格式。fastp文件一般每4行为一个read：分别为第1行主要储存序列测序时的坐标信息等；第2行是测序得到的序列信息，一般用ATCGN(N 代表的是未确定的碱基（N 表示 "unknown" 或 "ambiguous" base）来表示。第3行以“+”开始，可以储存一些附加信息，一般是空的。第4行储存质量信息，与第2行的碱基序列一一对应。每个符号对应的ASCII值成为phred值，可以简单理解为对应位置碱基的质量，越大说明测序质量越好。
2.数据质量过滤
数据质量检测(FastQC、MultiQC)
fastqc *.fastq #生成质控报告
multiqc *.zip #整合为一个文件
或者保存为一个脚本，
#!/bin/bash
# 定义FastQC输出目录
fastqc_output_dir="fastqc_results"
# 创建FastQC输出目录（如果不存在）
mkdir -p $fastqc_output_dir
# 并行运行FastQC
parallel fastqc -o $fastqc_output_dir ::: *.fastq
# 定义MultiQC输出目录
multiqc_output_dir="multiqc_results"
# 创建MultiQC输出目录（如果不存在）
mkdir -p $multiqc_output_dir
# 运行MultiQC整合结果
multiqc -o $multiqc_output_dir $fastqc_output_dir/*.zip
echo "FastQC分析和MultiQC整合完成。"
echo "FastQC结果保存在 $fastqc_output_dir 目录中。"
echo "MultiQC结果保存在 $multiqc_output_dir 目录中。"然后运行
chmod +x qc_analysis.sh #赋予权限
./qc_analysis.sh #运行脚本FastQC、MulitiQC结果：
基本信息：展示了样本名称、测序数据格式、数据量等基本信息。
序列质量分布：碱基质量得分（Per sequence quality scores）：在每个碱基位置上，以 Phred 质量分数来衡量碱基的准确性。质量分数越高，碱基识别的准确性越高。一般来说，质量分数大于 30 表示碱基错误率低于 1%，是比较好的质量。如果某区域的碱基质量得分整体偏低，可能意味着该区域的测序质量较差，需要进一步分析原因。质量分布曲线（Per base sequence content）：通过曲线展示整个序列上碱基质量的分布情况。理想情况下，曲线应该是平滑且位于较高质量分数区域的。通常四条线应尽可能平行，并保持在 25% 附近。如果曲线出现明显的波动或在低质量分数区域有较多分布，说明测序数据质量可能存在问题。
GC 含量：正常的测序数据中，GC 含量在一个合理的范围内，并且在不同的样本之间应该相对稳定。如果某个样本的 GC 含量明显偏离预期范围，可能提示存在样本特异性的问题，如样本中存在高 GC 或低 GC 含量的区域，或者测序过程中存在偏差。
序列重复水平：过高的序列重复水平可能表示存在 PCR 扩增偏好性或样本中存在大量的重复序列。如果是 PCR 扩增偏好性导致的，可能会影响对基因表达量的准确评估，需要在后续分析中进行校正。
接头序列：如果检测到接头序列，说明测序数据中存在接头污染。接头污染可能会影响序列比对和后续的分析结果，需要进行接头去除处理。
整体样本质量概览：在 MultiQC 整合的报告中，首先会有一个整体的样本质量概览，通过各种图表和统计数据展示所有样本的关键质量指标，如平均碱基质量、GC 含量分布、测序深度等。可以通过这些概览信息快速了解所有样本的整体质量情况，以及样本之间的差异和一致性。
样本间比较：质量指标分布比较：例如碱基质量分布、GC 含量分布等在不同样本间的比较。如果发现某些样本的质量指标与其他样本存在明显差异，需要进一步调查原因，可能是样本制备过程中的差异，也可能是测序过程中的问题。测序深度比较：展示不同样本的测序深度分布情况。测序深度的差异可能会影响基因表达量的检测和分析，需要确保各个样本的测序深度在合理范围内且相对均匀，以便进行准确的比较和分析。
模块汇总：MultiQC 会将 FastQC 的各个分析模块进行汇总展示，方便用户快速定位到每个样本在不同方面的质量情况。例如，可以通过模块汇总快速查看哪些样本存在较高的序列重复水平，哪些样本的 GC 含量异常等。
用fastqc看数据质量，发现没有什么问题的话，以下步骤可以不用进行，直接进行比对。
数据过滤
测序得到的原始序列含有接头序列和低质量序列，为了保证信息分析的准确性，需要对原始数据进行质量控制，得到高质量序列(Clean Reads)，原始序列质量控制的建议标准为：
接头：去除含接头的reads；
序列质量：过滤去除低质量值数据，确保数据质量；
N碱基比例：去除含有N(无法确定碱基信息)的比例大于5%的reads
数据过滤的两个工具：Trim_Galore 和 Fastp
#完整流程
graph LR
A[原始数据: *_1.fastq.gz, *_2.fastq.gz] --> B{生成config文件}
B --> C[Trim Galore质控]
C --> D[Clean数据: *_val_1.fq.gz, *_val_2.fq.gz]
C --> E[FastQC报告]
C --> F[日志文件]
#检查结果（1）生成config文件
#(1)生成config文件
wkd="/xxx/sra"
mkdir -p $wkd/clean
ls $wkd/*.fastq > $wkd/clean/config # 直接保存路径到config
#双端
# 生成双端样本的config文件（两列：fq1 fq2）
ls $wkd/*_1.fastq.gz | sed 's/_1.fastq.gz//' > $wkd/clean/samples.list
while read sample; do
echo "${sample}_1.fastq.gz ${sample}_2.fastq.gz" >> $wkd/clean/config
done < $wkd/clean/samples.list
head $wkd/clean/config # 检查config内容
（2）脚本qc.sh（脚本均以单端测序为例，双端自行改动）
#!/bin/bash
# 设置变量
bin_trim_galore=trim_galore
dir="/xxx/clean"
config=$1 # 输入参数，如config文件路径
# 检查Trim Galore是否安装
if ! command -v $bin_trim_galore &> /dev/null; then
echo "Error: Trim Galore not found. Install with 'conda install -c bioconda trim-galore'"
exit 1
fi
# 检查config文件是否存在
if [ ! -f "$config" ]; then
echo "Error: Config file $config not found!"
exit 1
fi
# 检查config文件是否存在
if [ ! -f "$config" ]; then
echo "Error: Config file $config not found!"
exit 1
fi
# 逐行处理config文件
while read fq1; do
echo "Processing $fq1..."
$bin_trim_galore \
-q 25 \ # 去除低于Q25碱基
--phred33 \ # 质量编码格式
--length 36 \ # 保留长度≥36的reads
--stringency 3 \ # 接头匹配严格度
--fastqc \ # 自动运行FastQC
-o $dir \ # 输出目录
$fq1 # # 输入文件
done < $config
echo "All done! Results saved to $dir"(3) 运行脚本
bash xx.sh /xx/xx （bash+脚本名称+参数）
bash qc.sh /xxx/sra/clean/config输出文件：*_val_1.fq.gz 质控后的Read 1；*_val_2.fq.gz 质控后的Read 2；*_unpaired_1.fq.gz Read 1中未配对的reads（若未丢弃）；*_fastqc.htmlFastQC报告*_trimming_report.txt处理日志。
执行完毕后，检查 $dir 中的 *_trimming_report.txt 确认过滤效果（如保留的reads比例）
PS:本篇为新手友好教程！ 每个步骤都附上了详细说明，并且刻意控制了单篇内容量，避免信息过载。如果有表述不准确的地方，欢迎在评论区或私信指教！你的建议会让教程变得更好~
参考资料：
RNA-seq: 7-alignment-3_哔哩哔哩_bilibili
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