RNA-seq数据分析——质量控制和预处理的软件

质量问题通常来源于测序本身或前面的文库制备。

• 它们包括可信度低的碱基、序列特异性差的偏差、3’/5’位置偏差、聚合酶链反应（PCR）假象、未修剪的接头，以及序列污染。
• 这些问题可能严重影响参考作图、组装及表达的估计，但这些问题很多可以通过过滤、修剪、纠错或偏差订正被矫正。
• 有些问题不能被纠正，但在解释结果时至少应该意识到它们。

读段的质量检查工具包括 FastQC 和 PRINSEQ，它们检查若干个质量指标，并提供可视化的报告。PRINSEQ软件包还提供过滤和修剪功能。

FastQC

• FastQC可以作为一个独立的Java程序使用，具有图形用户界面，也容易在命令行上使用。它还集成在 Galaxy 和 Chipster 平台上，这两个平台为大量的分析工具提供了GUI。
• FastQC相对较快，只需要几分钟来运行数千万的读段。
• 输入的文件可以是 FASTQ（未压缩或压缩的）或 SAM/BAM 文件。
• 除了列出读段的数目及其质量编码，FastQC 还报告并可视化有关的碱基质量和内容、读段长度及 k-mer 内容的信息，也有含糊不清的碱基、过度代表的序列和重复的信息。

PRINSEQ

• PRINSEQ 是一个Web程序，也提供了一个可使用命令行的单机板。它在Chipster GUI中也是可用的。
• PRINSEQ 质量控制报告包括读段的数目及其长度分布、碱基质量分布、序列复杂性、GC含量、模糊碱基（N）的存在、polyA/T 尾巴、重复和接头。如果检测到这些方面的任何问题，PRINSEQ的修剪和过滤选项提供各种不同的方式来处理它们。
• PRINSEQ 接受未压缩的 FASTQ、FASTA 和 QUAL 文件。
• 质量报告、修剪及过滤是用 Perl 程序 prinseq-lite.pl 完成的。可以在一个命令中结合许多修剪和过滤选项。其处理顺序不依赖如何在命令中列出它们，因为它是在 PRINSEQ 中硬编码的。
• PRINSEQ 可产生文本或 html 格式的质量报告。为了创建一个 html 报告，需要两个命令：

#第一个制作一个临时的图形文件：
prinseq-lite.pl -fastq reads.fastq -phred64 -out_good null -out_bad null -graph_data graph
## 由于不执行任何预处理，因此不会有任何接受的或丢弃的读段，将这些命令的输出文件（-out_good, -out_bad）设置为 null。
## 添加了限定符 -phred64, 因为示例数据使用 Illumina 的旧的质量编码。
## 可以只要求质量统计量的一个子集，以减少内存消耗和运行时间。例如，添加 -graph_stats ld,gc,qd,ns,pt,ts,de 将跳过序列复杂性和二核苷酸计算，并只报告精确的重复（而不是还要报告 5'端和 3'端重复）。

# 图形文件用于创建 html 文件。
# -o 参数给出文件前缀，因此该命令生成一个文件 QCreport.html:
prinseq-graphs.pl -i graph -html_all -o QCreport 

Trimmomatic

• Trimmomatic 是一个基于Java的多功能的工具，用于预处理读段。可以通过命令行或在 Galaxy 或 Chipster 中通过 GUI 使用它。
• Trimmomatic 可以删除接头，而且以基于质量的不同的方式对读段进行修剪。
• 它也可以基于质量和长度对读段进行过滤，并将碱基质量从一种编码系统转换成另一种。
• 可以使用一个命令执行集合步骤，按所需的顺序列出它们。
• 输入和输出是 FASTQ 文件，可以被压缩。
• Trimmomatic 是多线程的，所以运行非常快。