空间转录组检测靶点定量技术----Digital Spatial Profiler（DSP）

hello，大家好，今天给大家分享一个新的空间转录组技术---Digital Spatial Profiler（DSP），目前公司打算引进，我们来看看这个空间技术又有什么样独特的角度。

技术背景，组织的空间异质性，不同区域的表达基因的差异

技术发展，bulk是统一体，单细胞精度高，但是我们的组织是一个有序的组织，细胞类型在空间位置上是不可能割裂的存在，那么，新的空间技术，就强调细胞与细胞之间的作用。

组织异质性的空间体现，不同区域的表达特征差异明显

技术原理

探针设计，这个长度大家要注意，二代测序。

GeoMx Digital Spatial Profiler 采用独家专利技术在抗体或者 RNA 上偶联 DNA Oligo。每个 DNAOligo 对应一个靶标，最高可达 96 个蛋白靶标或>1000 个 RNA 靶标（二代测序输出）。当抗体或 RNA 与组织上的靶标结合后，GeoMx DigitalSpatial Profiler 利用激光切断 DNA oligo 与抗体或 RNA 之间的连接物，从而释放出 DNA Oligo 以进行下一步定量。

产品特点

多靶标

Nanostring 生物技术的 GeoMx Digital Spatial Profiler 一天之内可以处理多达 20 个组织切片样本。每个样本可以包含多达 96 个蛋白和>1000 个 RNA 靶物。

多组学

如何在同一组织样本中实现多组学研究向来是临床医学的棘手问题。目前市面上现有平台受制于技术，只能进行 RNA 或者蛋白测定。而 GeoMx Digital Spatial Profiler 则正好填补了这一空白。它不仅可以一次性测定多达 96 个蛋白，而且还可以同时进行多过 1000 个 RNA 靶物的测定，完美实现多组学研究。

高精度

激光激活的精度范围最小为 10 微米，可达到单细胞水平。因此研究人员可以对极其稀有的细胞群体进行捕获。（这个地方大家要注意，还是无法真正做到单细胞水准）。

样本无损

整个操作过程于样本无接触无损伤。同一样本可以重复使用并用于其他实验。

弹性选择感兴趣区域（ROI）

由于不同组织的独有特点，研究人员往往在单一载玻片上可能对某一区域特别感兴趣。在保留组织样本完整性的情况下，GeoMx DigitalSpatial Profiler 可以允许使用者在单张载玻片上根据组织轮廓选取感兴趣区域（Region Of Interest, ROI），甚至选取稀有细胞群体进行分析。

区域选择，下图中的组织形态位置，大家可能对不同研究区域进行分区研究（示例用圆圈选择ROI）

面对这样的选择，还是不够精细，这个时候需要根据荧光颜色信号再次进行分选，精细切割（segments）

当然，有很多情况复杂的肿瘤组织

目前在挑选ROI的时候呢，可以对一个ROI区域依据荧光信号进一步划分，总体来说，在marker抗体染片的时候是比较重要的。

使用简单

GeoMx Digital Spatial Profiler 操作简单。数据分析不需要额外的生物信息分析支持，有利于生物标志物的快速发现。研究人员可以根据实验需要采取自动挑选或者手动挑选结合的方式。

操作流程

1. 多靶标抗体染色

2. 根据荧光抗体染色图像挑选感兴趣区域（Region of Interest, ROI）

3. 对每个 ROI 进行 UV 照射，切割下 Oligo

4. 毛细管吸取仅限于 ROI 的 Oligo, 全程与样本无直接接触

5. 吸取的 Oligo 转移至 96 孔板中。

6. 步骤 3-5 会重复直至所有 ROI 的 Oligo 都收集完毕

7. 所有 ROI 中的 Oligo 分别收取完后，将在 NanoString 生物技术的 nCounter 上进行定量

*荧光抗体及靶标抗体在同一步骤染色，无需重复加样和染色

*步骤 4-6 为全自动操作，无需研究人员操作。

数据分析

在 Oligo 定量结束后，研究人员可以在 GeoMx Digital Spatial Profiler 的数据分析系统上整合形态学图像以及数字化定量的数据，把 ROI 在组织上的空间位置以及区域内所有靶标的表达水平相互关联起来，以达到在单一操作界面上同时观察空间定位，细胞形态和靶标表达的相关性。

对于我们生物信息而言，还是用代码处理

数据展示

当然了，肯定会有很多个性化的分析点，值得我们深入研究。

我们看看文献中的运用

单细胞数据DSP的联合分析，ROI区域的细胞组成

最后看看在新冠中的运用

新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）是由 SARS-CoV-2 病毒引发的，其感染程度可以由无症状感染发展到重症新冠肺炎甚至死亡。导致新冠肺炎病人死亡的主要原因是急性肺损伤和急性呼吸综合征，或者是多器官衰竭的直接并发症。然而到目前为止，对于 COVID-19 患者各器官的分子生物学和细胞生物学层面的了解还不太深入。

接下来，分享近期Nature 杂志在线报道的一篇来自由Broad Institute、Massachusetts General Hospital、Brigham and Women's Hospital、Beth Israel Deaconess Medical Center、Massachusetts Institute of Technology、Harvard Medical School等多家研究机构合作完成的题为 “ COVID-19 tissue atlases reveal SARS-CoV-2 pathology and cellular targets ” 的文章。该研究综合应用单细胞测序技术和DSP空间转录组技术全面构建了新冠患者的肺、肝、肠等各个器官组织的单细胞图谱以及空间图谱，并分析了其基因表达特征。

研究思路

• 图1：研究思路

• 图2：实验及分析流程

主要研究结果

01

COVID-19患者肺的细胞图谱

利用自动细胞类型识别工具，作者在 COVID-19 患者的肺部组织单细胞（核）图谱中注释了28种细胞类群，包括实质细胞、内皮细胞和免疫细胞等。与正常肺部细胞组成相比，COVID-19 患者肺部的II型肺泡细胞（AT2）数量显著减少，而树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、成纤维细胞以及内皮细胞数量都有所上升。COVID-19 患者的II型肺泡细胞中大量与宿主病原体反应相关的基因上调，而预防肺部纤维化的肺表面活性物质基因出现下调。新冠肺炎患者的肺细胞中存在更多的 PATS（Pre-alveolar type 1 transitional cell state）基因表达，且一部分PATS同时表达了KRT8 / CLDN4 / CDKN1A 和KRT5 / TP63 / KRT17 基因，这些PATS细胞有可能是TP63+肺内基底样组细胞（Intrapulmonary basal-like progenitor cells，IPBLP），用于肺泡严重受损时的紧急细胞储备。基于这些结果，作者提出了肺泡表皮细胞再生的模型：（1）健康肺泡中的II型肺泡细胞会自我再生并且能通过转分化的过程转化成I型肺泡细胞。（2）在 COVID-19 患者的肺泡中，II型肺泡细胞的自我再生和向I型肺泡细胞的转化均被抑制，导致PATS细胞的累积，在远端呼吸道的 IPBLP 细胞开始向肺泡迁徙。

• 图3：COVID-19 患者肺部单细胞（核）图谱

02

肺细胞中富集SARS-CoV-2病毒RNA

与之前的研究结果一致，研究者发现新冠病毒载量（Viral load）与患者出现症状到死亡的天数呈负相关。在肺部的不同细胞类型中，髓细胞（Myeloid cells），特别是 CD14high CD16high 炎性单核细胞和 LDB2high OSMRhigh YAP1high巨噬细胞含有更多的 SARS-CoV-2 病毒RNA。值得注意的是，这些表达 SARS-CoV-2 病毒RNA的细胞并不同时表达 ACE2 ，TMPRSS2 等病毒进入因子。

• 图4：吞噬细胞和内皮细胞富集 SARS-CoV-2 病毒的RNA

03

COVID-19 患者肺部的空间图谱

研究者采用 NanoString GeoMx 数字空间分析（Digital Spatial Profiling，DSP）技术构建了尸检样本肺部细胞的空间转录组学图谱。结果显示上皮细胞（PanCK+）区域中I型肺泡细胞和II型肺泡细胞占主导地位。在非上皮细胞（PanCK-）区域中，新冠患者比非新冠患者（D22-D24）有更多的成纤维细胞和肌成纤维细胞。

比较 COVID-19 患者和非 COVID-19 患者肺部对应的AOIs区域，发现在新冠患者肺部的interferon-α 和 γ 响应基因及氧化磷酸化相关基因表达显著提升，而 TNFα、IL2-STAT5 和TGF 信号通路、顶端交界和缺氧通路相关基因表达显著下降。

相同尸检样本中发炎和未发炎的 AOIs 比较，发现发炎 AOIs 区域中与先天免疫和发炎相关的基因表达量有显著增加。相应地，Claudins 和紧密连接通路相关基因表达下降。

另外，对比 COVID-19 患者中 SARS-CoV-2 病毒含量高的 AOIs 区域与 SARS-CoV-2 病毒含量低的 AOIs 区域，发现病毒基因ORF1ab、S 基因被诱导，趋化因子基因（CXCL2 和CXCL3 ） 的表达量有显著上升。而值得注意的是，NT5C 基因的表达量在 SARS-CoV-2 高的 AOIs 区域中也有显著提升，目前还不清楚这个基因在肺损伤中的作用，其具体作用需要进一步研究。

• 图5：COVID-19 患者肺和正常肺，COVID-19 患者肺感染区和非感染区细胞组成和基因表达比较

04 COVID-19影响心脏，肾脏和肝脏的细胞组成

COVID-19 新冠肺炎尸检样本肝脏、心脏和肾脏的单细胞核图谱中发现少量 SARS-CoV-2 病毒RNA，这可能和单细胞核RNA有关，后续可以通过 NanoString DSP 和 RNAscope 验证。比较 COVID-19 患者的心脏和正常心脏组织的单细胞核图谱，研究者发现 COVID-19 患者的心肌细胞和周细胞比例显著降低，而血管内皮细胞比例显著增加。在心肌细胞、周细胞或成纤维细胞中的基因上调包括PLCG2 和AFDN。周细胞、心肌细胞和成纤维细胞中，上调的通路包括氧化应激诱导的细胞凋亡通路、细胞粘附和免疫通路、细胞分化通路。

• 图6：COVID-19 患者心脏、肝脏肾脏单细胞（核）图谱

结论

综上所述，在本研究中作者综合单细胞测序技术及 DSP 空间转录组测序技术全面构建了 COVID-19 患者肺、肾、肝和心脏组织的单细胞（核）图谱以及肺的空间图谱，并基于COVID-19 GWAS 找到了具体的细胞类型与新冠肺炎的遗传风险之间的关联，这些单细胞及空间图谱为揭示新冠肺炎病毒导致人体器官衰竭以及最终死亡的病理提供了重要依据。

看来DSP空间转录组技术还是值得信赖的

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