表达谱芯片原理

一、Agilent芯片生产原理

参考：《陈巍学基因》笔记(29)Agilent生物芯片原理

Agilent芯片的基片是一个玻璃片。它的大小和一张标准的病理载玻片一样大小。

它的芯片制作过程，是用和喷墨打印一样的技术来进行制作的。喷墨打印机，是在墨盒里面是装了“红、黄、蓝、黑”四种颜色的墨水。而Agilent打印生物芯片的墨盒里面，是用带保护基团的A/C/G/T四种碱基底物，来代替了颜色墨水。分别含有4种碱基底物的小液滴，被按照设计的探针序列，依次、层叠地喷到玻璃板的确定的位置上。

在每一个碱基的延伸过程当中都有 3 个步骤，分别是偶联、氧化、 去除保护基团， 即先把一个核苷酸喷到玻璃板上，然后再喷上第二个碱基，让两个碱基之间发生偶联，继而 经过氧化，把亚磷酸基团氧化成磷酸基团。然后，把连在第二个碱基 5’ 位羟基上的 DMT 保 护基团去掉， 留下一个自由的 5’ 位羟基，再进行下一步的延伸反应。不断重复这个过程， DNA 链就会不断地延长。Agilent 的这个 DNA 链合成技术，每一步的合成效率都非常高，可 以达到 99%以上。这让 Agilent 可以在芯片上得到很长的 DNA 链， 最长可以达到 300 个碱基 的长度。

通过上述步骤即获得一张布满DNA探针的测序芯片 

二、检测表达量

1. 用带有 T7 启动子序列的 Poly(T)引物，与 mRNA 的 Poly(A)尾巴结合，逆转录出第一链 cDNA。

   

2. 转录得到双链 cDNA。

3. 由于双链 cDNA 带 T7 启动子，可以将其转录出 cRNA。

   

   其中，CTP 底物带有 Cy3 荧光标记，能被带入新合成的 cRNA 中。

4. 将 cRNA 与芯片杂交，扫描，根据每个探针的荧光强度反推其基因表达量（本质上是检测荧光强度）

三、单通道和双通道

判断GEO芯片数据是双通道还是单通道 - 组学大讲堂问答社区

双通道和单通道

从双通道（cDNA芯片）到单通道（寡核苷酸芯片）是基因芯片技术发展进程中重要进步之一。

• 双通道主要用于cDNA芯片，即用两种荧光的比值反应基因表达水平（红色通道和绿色通道），比如处理前用一种荧光标记，处理后用另一种荧光标记，二者竞争性杂交。
• 单通道是指只用一种标记物标记，点的荧光强度可以反映基因表达水平，如寡核苷酸芯片Affymetrix。

标准化： 在芯片实验中，各个芯片的绝对光密度值是不一样的，在比较各个芯片结果之前必需将其归一化（normalization，也称作标准化）。在同一块芯片上杂交的、由不同荧光分子标记的两个样品间的数据即双通道数据，也需归一化。标准化的概念现在只要记住一点：在数据分析时需要利用某些算法对不同芯片或者同一芯片不同通道的数据进行统一，从而使其之间可以进行比较。

相关标准化算法资料可以在提供的后续阅读材料中获取。