生信小白都会的转录组数据分析流程

在Galaxy生信云平台，无需任何代码，即可从下机数据开始，分析得到转录组的表达量矩阵。

有了生物信息界的新物种，生信云。从此不需要购置服务器，不需要学习编程，生信小白也可以进行生物信息数据分析了。

工具地址

Galaxy中国（UseGalaxy.cn）> RNA ANALYSIS TOOLS > Standard Analysis > 有参转录组标准分析

功能描述

本工具用于转录组二代测序数据的标准分析，可生成表达量矩阵和测序数据质控结果。

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这是一套非常流行的转录组定量分析流程，即 Hisat2 + Stringtie 经典组合，其步骤为：

1. fastp，进行质量控制，去除测序数据中不合格的序列，保留高质量序列用于后续分析；

2. hisat2，将经过质控得到的 Clean data，比对到参考基因组上；

3. samblaster，去除PCR或光学重复;

4. samtools，去除不合格的比对序列，将 SAM 文件转换成 BAM 文件；

5. stringtie，结合 hisat2 得到的比对文件（BAM）和基因组注释文件（GTF），进行定量分析，得到每个样本的表达量文件（FPKM / TPM）；

6. prepDE.py，将 FPTM / TPM 转化为 Counts 计数的表达量矩阵，用于后续差异基因等分析。

操作步骤

1. 创建一个新的历史面板

在网站右侧的历史面板上方，点击 + 号，创建一个新的历史面板，可以为新面板取一个名字，如：Three Yeast Test。

2. 数据准备

2.1 共享数据的使用方法

如果使用测试数据，可以在网站上方菜单栏，找到：

• 数据共享 > 数据库 > RNA-seq > Three Yeast

可以看到6个Fastq文件，是3个酵母样本的双端测序数据（抽样数据用于工具测试） 。

• 全选6个Fastq文件。

• 点击上方 Add to History 按钮，点击 as Datasets，将数据添加到刚才新建的历史面板。

回到网站主页，可以在历史面板中看见刚才添加的6个Fastq文件：

至此我们学习了添加共享数据到历史面板的方法。

2.2 自有数据的上传方法

我们再来看看如何上传自己的数据，同样，增加一个新的历史面板，并为其取一个有意义的名称，如 RNAseq Test Using Tree Yeast。

• 点击网站左侧的 Upload Data。

• 点击 选择本地磁盘文件。

• 选择要上传的Fastq文件（可以多选），点击 打开。

• 回到上传工具界面，点击开始。

• 点击 Close 等待上传完成。历史面板中的文件名都变成绿色后，表示上传完成。

3. 制作 List of Pairs

放松，不要被概念吓倒，其实就是把所有Fastq文件的文件名放到一个列表中。

• 点击历史面板中的 选择按钮，然后点击 Select All。

• 然后占开下拉菜单，点击 Build List of Dataset Pairs。

在弹出的界面中，可以看到，6个Fastq文件已经自动配成3对了(来自于同一个样本的Read1 / Read2配对)。

绿色部分：

• 左边是 Read 1

• 右边是 Read 2

• 中间是样本名

这时候可以看到，中间的所有样本名最后都有一个 .fastq 后缀，说明自动配对得不完美，我们可以指定Fastq文件的后续，实现更加精确的配对。

PS：当然这不是必须的，现在配对的情况已经可以用于后续分析了，我们去掉样本名中的.fastq后缀，仅仅是为了视觉上更简洁。

• 点击 Unpair All，可以看到数据变成了未配对状态。

• 我们指定更精确的Fastq文件名后缀。在左侧文本框输入：_1.fastq.gz，在右侧文本框输入：_2.fastq.gz。然后点击 Auto-pair。

可以看到，现在匹配得更加精确。

• 我们为数据集取一个名字，如：Theee Yeat RNA，点击 Create collection 即可。

回到历史面板，我们看到，原来的Fastq文件已经隐藏了，面板中出现了一个新的数据集：

现在，我们可以正式运行转录组工具了。

4. 运行工具

进入工具页面：

• 测序数据：选择刚才创建的数据集。

• 参考基因组：选择 Yeast (partial genome, just for test)，因为我们教程中用的是3个酵母样本测序数据的一小部分用于工具测试。

目前支持人类 GRCh37 / GRCh38 基因组。如果没有你需要的基因组，请联系管理员添加。

• Dry Run，该按钮为 Yes，会生成流程的任务脚本，不会执行，通常用于测试设置的完整性，在此保持默认值：No

• 点击 Run Tool，等待分析结果。

5. 任务查看

历史面板中结果文件名的前面一直在转圈，说明任务正在运行。

若转圈停止：

• 结果文件名变为绿色，表示任务运行成功。

• 结果文件名变为红色，表示任务运行失败。

最后：

• 点击文件旁的 眼睛 图标，可以查看文件内容。

• 点击文件名，待文件区域展开后，再点击 磁盘 图标，即可下载结果文件。

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