跟着Nature Communications学16S rRNA基因生信分析 | 小鼠肠道菌群和胆汁酸代谢引发焦虑样障碍...

最新推荐文章于 2025-03-25 19:49:39 发布

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心理健康受全球关注，神经精神疾病患者增多，焦虑最普遍。气候与负面情绪和精神疾病有关，全球变暖下湿热环境影响心理健康受关注，但机制不明。肠道菌群与环境相关疾病有关，经肠 - 脑轴连中枢神经系统，参与胆汁酸代谢影响神经炎症和突触可塑性。本研究探究湿热环境对大脑和肠道菌群的影响及机制以提供干预依据。

论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-49972-w

研究团队运用转录组学、代谢组学与宏基因组学技术，阐明了湿热环境是怎样经由破坏肠道微生物群和胆汁酸代谢，从而导致类焦虑行为以及神经炎症的，这为领会环境因素对心理健康的作用给予了全新的认识。文章中部分测序数据可在Galaxy生信云平台（网站：usegalaxy.cn）上分析，无需写代码，无需安装软件配置环境。

摘要

气候变化威胁心理健康，湿热环境对神经精神疾病影响不明。本研究以雄性小鼠为模型，发现湿热环境致其焦虑、肠道菌群失调（鼠乳杆菌丰度降）、血清次级胆汁酸（石胆酸）升高，血清和大脑皮层促炎因子表达增加、PI3K/AKT/NF - κB通路激活、小胶质细胞反应增强，神经炎症加剧。湿热环境饲养小鼠的肠道菌群移植到无菌小鼠可重现异常，补充鼠乳杆菌可逆转。人类样本也显示湿热季节鼠乳杆菌丰度降、石胆酸浓度升。研究表明湿热环境致肠道菌群失调经损害胆汁酸代谢和加剧神经炎症推动焦虑障碍发展，补充益生菌是潜在治疗策略。

研究背景

心理健康受全球关注，神经精神疾病患者增多，焦虑最普遍。气候与负面情绪和精神疾病有关，全球变暖下湿热环境影响心理健康受关注，但机制不明。肠道菌群与环境相关疾病有关，经肠 - 脑轴连中枢神经系统，参与胆汁酸代谢影响神经炎症和突触可塑性。本研究探究湿热环境对大脑和肠道菌群的影响及机制以提供干预依据。

研究结果

湿热环境引发小鼠焦虑样行为并破坏皮质兴奋/抑制（E/I）平衡

1. 行为学测试：HHE组小鼠在旷场实验中穿越中央区域的时间减少（图1b），在高架十字迷宫中进入开放臂的时间减少（图1c），表明出现焦虑样行为，但抑郁样行为未明显改变（图1d - f）。雌性小鼠在湿热环境中未出现行为异常，因此后续实验仅使用雄性小鼠。

图1：湿热环境导致小鼠出现焦虑样行为并破坏皮质E/I平衡
2. 电生理记录：对内侧前额叶皮质（mPFC）锥体神经元进行电生理记录，发现HHE组小鼠sEPSC平均频率显著增加（图1g, h），但振幅无变化（图1i），sIPSC频率和振幅在两组间相似（图1j - l），表明HHE组锥体神经元E/I比值升高。
3. 蛋白表达分析：免疫染色和蛋白质免疫印迹结果显示，HHE组小鼠mPFC中vGlut1（兴奋性囊泡标记物）表达增加，而vGAT、GAD65（抑制性神经元标记物）和突触素表达无明显变化，这与电生理结果一致，表明HHE组锥体神经元接受更多兴奋性输入。

湿热环境改变肠道菌群组成及相关血清代谢物

1. 肠道菌群分析：HHE组小鼠体重和盲肠大小显著低于NC组（图2a, b）。16S rRNA基因测序结果显示，实验开始前两组小鼠肠道菌群的α和β多样性相似，但45天后，HHE组肠道菌群β多样性与NC组差异显著（图2c, d），α多样性增加（图2e）。HHE组有10种细菌丰度发生显著变化，包括鼠乳杆菌丰度降低，几种益生菌（如肠乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和嗜黏蛋白阿克曼菌）水平几乎检测不到（图2f）。生态网络分析表明，鼠乳杆菌与其他益生菌之间存在协同关联（图2g）。

图2：湿热环境损害肠道菌群和肠道菌群相关代谢物
2. 血清代谢物分析：代谢组学分析显示，HHE组血清代谢谱与NC组显著不同，有35种代谢物表达改变，主要富集在次级胆汁酸生物合成等代谢途径（图2h - i）。HHE组血清中多种胆汁酸水平升高，尤其是石胆酸（LCA）（图2j - k）。相关性分析表明，鼠乳杆菌等细菌丰度与LCA表达呈负相关（图2l）。
3. 人体样本分析：在湿热季节收集男性受试者样本，发现其肠道菌群结构改变，鼠乳杆菌丰度降低，血清LCA水平升高，且血清TNF-α水平有上升趋势。

HHE组粪便微生物移植重现GF小鼠肠道菌群改变和焦虑样行为

1. 肠道菌群变化：将HHE组和NC组小鼠粪便移植到GF小鼠后，GF - HHE组小鼠肠道菌群α多样性显著高于GF - NC组（图3b），β多样性明显分离（图3c）。GF - HHE组中鼠乳杆菌、肠乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和嗜黏蛋白阿克曼菌等细菌丰度显著降低（图3d），血清LCA水平显著升高（图3g）。

图3：粪便移植在GF小鼠中重现肠道菌群改变和焦虑样行为
2. 行为学和电生理变化：行为学测试显示，GF - HHE组小鼠在旷场实验中穿越中央区域时间减少（图3h, i），在高架十字迷宫中进入开放臂时间减少（图3j, k），出现焦虑样行为。电生理记录表明，GF - HHE组锥体神经元sEPSC频率显著增加（图3l, m），vGlut1蛋白水平也显著升高，进一步证实肠道菌群改变与焦虑样行为的关联。

HHE和GF - HHE组小鼠肠道屏障和血脑屏障（BBB）通透性增加，炎症反应增强

1. 肠道屏障功能受损：HHE和GF - HHE组小鼠肠道紧密连接蛋白claudin - 1和ZO - 1表达降低（图4a - b），血清FITC - 葡聚糖水平升高（图4c），表明肠道屏障通透性增加。同时，肠道结构萎缩，绒毛高度降低（图4e）。

图4：湿热环境导致肠道屏障和BBB受损并激活神经炎症
2. BBB通透性增加：HHE和GF - HHE组小鼠BBB通透性增加，伊文思蓝（EB）染色显示大脑中EB信号增多（图4g - k），BBB相关蛋白claudin - 1、occludin - 1和ZO - 1表达下调（图4l）。
3. 炎症反应增强：HHE组小鼠血清和大脑皮层中多种炎症因子（如IFN - γ、TNF - α等）表达上调（图4d, m），小胶质细胞激活，与神经元的相互作用增强（图4n - o）。尾静脉注射LCA实验表明，LCA可增加炎症因子表达，下调紧密连接蛋白表达，进一步证明LCA在炎症反应中的作用。

HHE和GF - HHE组小鼠大脑中PI3K/AKT/NF - κB信号通路增强

1. 基因表达分析：RNA测序显示，HHE组小鼠大脑皮层有391个基因上调，48个基因下调。KEGG分析表明，差异表达基因主要富集在PI3K - AKT等炎症相关信号通路（图5a - b）。GSEA分析显示，HHE组PI3K - AKT信号通路显著上调（图5c）。

图5：HHE和GF - HHE组小鼠大脑皮层中PI3K/AKT/NF-κB信号通路增强
2. 蛋白表达分析：RT - PCR和蛋白质免疫印迹结果证实，HHE组小鼠大脑中PI3K、AKT1和NF - κB1的mRNA和蛋白水平均显著升高（图5d - f），且磷酸化PI3K和AKT水平与血清LCA水平呈正相关（图5g）。GF - HHE组小鼠也有类似变化（图5h - j），同时该组中TNF炎症通路关键分子Cxcl1和Cxcr2的mRNA水平显著增加（图5k），表明湿热环境诱导的肠道菌群改变激活了大脑中的PI3K/AKT/NF - κB信号通路和神经炎症。

补充鼠乳杆菌可逆转HHE组小鼠异常

1. 行为学改善：给予HHE组小鼠鼠乳杆菌、罗伊氏乳杆菌或嗜黏蛋白阿克曼菌干预后发现，鼠乳杆菌和罗伊氏乳杆菌可增加小鼠在旷场实验中央区域的停留时间，三者均可增加小鼠在高架十字迷宫开放臂的停留时间，其中鼠乳杆菌效果最显著。
2. 生理指标变化：补充鼠乳杆菌后，HHE + L组小鼠肠道菌群β多样性与HHE + S组差异显著，鼠乳杆菌和罗伊氏乳杆菌丰度增加，Firmicutes和Actinobacteria门细菌丰度恢复（图6b）。血清LCA水平降低，粪便LCA水平升高（图6c - d），表明鼠乳杆菌促进LCA排泄。同时，HHE + L组小鼠焦虑样行为减轻（图6e），血清TNF - α表达降低（图6f），mPFC锥体神经元sEPSC频率恢复正常（图6h），PI3K/AKT/NF - κB信号通路激活得到逆转（图6m）。

图6：鼠乳杆菌治疗逆转HHE组小鼠的异常

基因测序及组学数据分析方法

16S rRNA基因测序和分析

提取小鼠粪便微生物基因组DNA，扩增16S rRNA基因V3 - V4区域，进行PCR产物纯化和测序。对测序数据进行质量过滤、去嵌合体处理，使用Uparse软件进行序列分析，将相似性≥97%的序列归为同一个OTU。进行α和β多样性分析，使用MaAsLin2（Galaxy云平台（网址:usegalaxy.cn）有集成此工具，可图形化操作无需安装软件和配置复杂环境）分析细菌物种差异丰度。

代谢组学分析

经过代谢物提取、非靶向LC - MS/MS分析、数据预处理和注释后，使用UHPLC - QTOF - MS系统进行分析，对MS数据进行处理和代谢物鉴定，通过KEGG注释和富集分析确定代谢途径。

RNA测序

提取新鲜大脑皮层样本RNA，评估质量后进行cDNA文库构建和RNA测序。计算基因表达量，筛选差异表达基因，进行KEGG富集分析和基因集富集分析（GSEA）。

参考文章：如何利用clusterProfiler进行基因集的KEGG富集分析？

统计分析

使用GraphPad Prism 8进行统计分析，根据数据分布选择合适的统计检验方法，对微生物β多样性进行PERMANOVA分析，所有行为学测试人员对分组信息不知情。

数据和代码可用性

研究数据可在论文及补充信息中获取，原始序列数据已提交至相关数据库。分析数据的软件可免费或商业获取，网络模块使用特定软件可视化。

研究结论

本研究表明，长期暴露于湿热环境会导致小鼠神经炎症、大脑皮质E/I失衡和焦虑样行为，其机制与肠道菌群失调、胆汁酸代谢异常有关。补充益生菌（如鼠乳杆菌）可调节肠道菌群和胆汁酸代谢，缓解这些异常，为治疗湿热环境相关焦虑障碍提供了潜在策略。但研究存在局限性，如神经炎症与焦虑障碍的特异性关系，以及湿热环境对人类神经精神健康的长期影响仍需进一步研究。