Molecular Plant: 王二涛课题组及合作者揭示丛枝菌根共生与根瘤共生的协同进化机制
丛枝菌根共生通过调节根际微生物促进豆科植物与根瘤菌共生
Mycorrhizal Symbiosis Modulates the Rhizosphere Microbiota to Promote Rhizobia Legume Symbiosis
Article，2020-12-09
Molecular Plant, [IF 12.08]
DOI：https://doi.org/10.1016/j.molp.2020.12.002
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1674205220304330
第一作者：Xiaolin Wang (王孝林)
通讯作者：Ertao Wang (王二涛)；Huan Liu (刘欢)；Xuebin Zhang (张学斌)
主要单位：
中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所，分子植物科学卓越中心 (National Key Laboratory of Plant Molecular Genetics, Chinese Academy of Sciences Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China)
深圳华大生命科学研究院 (State Key Laboratory of Agricultural Genomics, BGI-Shenzhen, Shenzhen 518083, China)
河南大学生命科学学院 (Center for Multi-Omics Research, Collaborative Innovation Center of Crop Stress Biology, Henan Province; Institute of Plant Stress Biology, State Key Laboratory of Cotton Biology, Department of Biology, Henan University, Kaifeng 475001, China)
中国农业大学生物学院 (State Key Laboratory of Agrobiotechnology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing 100193, China)
上海师范大学生命科学学院 (Shanghai Key Laboratory of Plant Molecular Sciences, College of Life Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)
西北农林科技大学林业学院 (College of Forestry Northwest A&F University, Yangling 712100, China)
南京师范大学生命科学学院 (Jiangsu Key Laboratory for Microbes and Functional Genomics, Jiangsu Engineering and Technology Research Center for Industrialization of Microbial Resources, College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China)
山东农业大学农学院 (State Key Laboratory of Crop Biology, College of Agronomy, Shandong Agricultural University, Taian, China)
上海翰宇生物科技有限公司 (Shanghai Hanyubio Co., Ltd, Shanghai 201201, China)
摘要
Abstract
植物与互利共生型真菌（如丛枝菌根真菌）及细菌（如根瘤菌）建立共生关系，以交换重要养分从而促进植物生长。植物根系与微生物建立共生是长期共进化的过程。丛枝菌根共生形成于4亿6千万年前，植物利用古老的丛枝菌根信号通路在其根部建立其它细胞内共生，包括豆科植物与根瘤菌共生。然而，自然土壤中丛枝菌根与根瘤共生之间的关系仍知之甚少。该研究通过对16S rRNA基因测序进行定量微生物群分析（QMP），探究了这些不同的共生如何影响蒺藜苜蓿根际及根内的细菌群落。研究人员发现无法建立丛枝菌根或根瘤共生的蒺藜苜蓿突变体的根际和根部微生物含量（定量丰度）发生改变，丛枝菌根共生是在自然土壤中组建正常的定量根际微生物群所必需。此外，定量微生物共发生网络分析表明，根瘤菌目的细菌在菌根共生正常的植物根际中处于核心地位，菌根共生的缺失影响了该网络的稳定性。该研究进一步通过根瘤菌rpoB基因和丛枝菌根真菌SSU rRNA基因的高通量测序和微生物群定量研究了根际微环境中丛枝菌根共生与根瘤共生之间的相互作用，发现丛枝菌根共生可以促进多种共生根瘤菌种群在根际的增殖。进一步研究表明，蒺藜苜蓿根际丛枝菌根共生影响的微生物群落可以促进自然土壤中不同豆科植物结瘤。
引言
Introduction
陆生植物根系与微生物建立多种多样的共生关系，例如，超过80%的陆生植物可以与丛枝菌根（arbuscular mycorrhizal, AM）真菌形成共生关系，其中豆科植物还可以与根瘤菌形成共生固氮关系。AM共生与根瘤共生可通过提高植物对磷和氮的获取能力，从而协同促进植物生长。AM真菌作为陆地生态系统的重要组成部分，是生态系统碳循环的关键环节。此外，AM真菌通过菌丝网络在地下连接植物，构成一个巨大网络，并且影响植物的多样性。植物根系与微生物建立共生是长期共进化的过程。丛枝菌根共生形成于4亿6千万年前，其共生信号通路被豆科植物进一步利用，参与建立豆科植物与固氮根瘤菌的共生。然而，我们对AM真菌与根瘤菌在陆地生态系统中的相互作用和协同进化却知之甚少。
生物间的协同进化依赖于相互作用，特别是生物体之间的合作和竞争。根周围的区域称为根际，该微环境代表了植物-微生物和微生物-微生物相互作用的主要生态位。植物根际微生物组被誉为植物的第二基因组，其对于植物的生长发育和环境适应至关重要。传统的根际微生物组研究主要通过细菌16S rRNA基因或真菌核糖体DNA内转录间隔区（internal transcribed spacers，ITS）序列的高通量测序来评估微生物种群的相对丰度，但该方法无法提供样品中微生物的绝对丰度，阻碍了跨界微生物间（如AM真菌与根瘤菌）相互作用的研究。实验室前期基于微生物群定量分析（quantitative microbiota profiling,QMP）发现，根际土中细菌的数目是根外土的近10倍，且主要菌门在根际土中的绝对丰度都被显著扩增，基于此我们提出了“扩增-筛选”的根际微生物组的组装新模型（Science Bulletin：上海植生所王二涛组发表基于绝对丰度的植物根际微生物群落“扩增-选择”组装模型）。
在这项最新的研究中，我们在自然土壤条件下种植野生型蒺藜苜蓿以及AM共生和/或根瘤共生缺陷的突变体，通过16S rRNA基因高通量测序和微生物群定量研究量化了根际和根样本中的细菌微生物量。我们发现，菌根共生缺陷显著降低了细菌微生物群——根瘤菌目尤为明显——在植物根际的增殖，并改变了根际及根内微生物组的种群结构。基于微生物共发生网络分析发现根瘤菌目的细菌在菌根共生正常的植物根际中处于核心地位，菌根共生的缺失影响了该网络的稳定性。该研究进一步通过根瘤菌rpoB基因和AM真菌SSU rRNA基因的高通量测序和微生物群定量研究了根际微环境中AM共生与根瘤共生之间的相互作用，发现AM共生可以促进多种共生根瘤菌种群在根际的增殖。最后，根际微生物群回接研究表明，AM共生影响的微生物群落可以促进自然土壤中不同豆科植物结瘤。
结果
Result
AM共生缺陷突变体在自然土壤中表现出不同的表型和根系转录组
Mutants Defective in AM Symbiosis Exhibit a Distinct Phenotype and Root Transcriptome in Native Soil
实验材料：野生型蒺藜苜蓿(WT: Jemalong A17)；仅AM共生缺陷的突变体(M-R +: pt4-1)；仅根瘤菌共生缺陷的突变体(M+ R-: ipd3-1, nfp-1和lyk3- 1)和两者共同缺陷的突变体(M-R-: dmi2-1和dmi3-1)。
与WT相比，在M-植物的根部，AM真菌VT(virtual taxa)的微生物数量较低，尤其在的AM共生缺陷的突变体dmi3和pt4的根部未检测到VT(图1A)。有趣的是，M+R-突变体的根部发现AM真菌VT的微生物数量相当或略高于WT(图1A)。为了验证AM 真菌VT的功能，我们检查了这些植物根中的总磷含量。与根部AM真菌 VT的微生物数量一致，M+R-植物根部的总磷最高，其次是野生型WT（图1B）。与野生型WT和M+R-植物相比，M-R+和M-R-突变体中的磷含量显著降低（图1B）。
转录组分析发现与M+植物根系(WT, ipd3-1, nfp-1和lyk3-1)相比，M-植物根系(pt4-1, dmi2-1, dmi3-1)表现出独特的转录组(图1C)。菌根诱导的基因在M-植物中没有被诱导(cluster 5、6和7; 图1C)。
图1A-C 在自然土壤中生长的野生型A17，根瘤和丛枝菌根共生缺陷突变体的微生物群和转录组谱。
(A)和(B) 估算了不同植物基因型根中菌根真菌Glomeromycota 18S rRNA基因的微生物数量(A)和总磷含量(B); (C) 3,606个在不同蒺藜苜蓿基因型的根系差异表达基因（DEG）的层次聚类。
共生影响根际区室中菌群的频率和数量
Symbiosis Affects both the Frequency and Load of Microbiota in Rhizocompartments
接下来，我们通过两种不同的方案计算了细菌群落的相对丰度(RMP，图1D)和细菌群落定量丰度(QMP，图1E)。
图1D-E 在自然土壤中生长的野生型A17，根瘤和丛枝菌根共生缺陷突变体的微生物群和转录组谱。
(D) 标准微生物群测序方案(RMP)计算的细菌相对群落组成; (E) 基于微生物群定量分析(QMP)计算的定量细菌群落组成。
标准RMP显示，野生型和突变型植物的根际和根部细菌在门分类水平的分布频率显著不同（图1D）。与WT相比，M-突变体根际样品中Alphaproteobacteria相对丰度减少，Gammaproteobacteria和Betaproteobacteria相对丰度增加，表明AM共生功能缺陷影响Proteobacteria在根际的定殖。 此外，与WT相比，M-突变体根中Actinobacteria的相对丰度降低以及Alphaproteobacteria，Chloroflexi和Deltaproteobacteria的相对丰度增加；在M+R-突变体中，Bacteroidetes和Betaproteobacteria的相对丰度降低，说明AM共生和根瘤菌共生均会影响细菌不同亚群在根部定植。
QMP数据显示，野生型和共生突变体间根和根际土壤中的细菌载量也显著不同（图1E）。与WT相比，M+R-突变体在根际中显示出较高的细菌数量，但在根部中显示出较低的细菌数量。相反，M-R-突变体在根际的细菌数量减少，但在根部的数量增加。有趣的是，pt4突变体（M-R+）在根部具有最低的细菌数量，这不能仅仅归因于磷含量的降低（比较图1E和图1B）。 QMP数据还显示，RMP观察到的细菌菌群频率变化并不总是反映其数量的变化（图1D和E）。
AM共生缺陷减少了根际中根瘤菌目进化枝的绝对丰度
Defects in AM Symbiosis Reduce the Load of Rhizobiales Clades in the Rhizosphere
基于QMP数据集的CAP(主坐标约束排序分析)与ANOSIM分析发现根际和根系所有M-突变体中的菌群均与能够形成AM共生(WT和M+R-突变体)的菌群沿第一个主坐标明显分开(根际：RANOSIM = 0.68, P < 0.0001; adj-R2 CAP = 0.27, P < 0.0001; 根: RANOSIM = 0.36, P < 0.0001; adj-R2CAP = 0.10, P < 0.0001) (图2A, B)。相反，单独的根瘤菌共生缺陷突变体（M+R-）不会导致对根际和根的细菌群落产生一致的影响(根际: RANOSIM = 0.15, P = 0.126; adj-R2 CAP = 0.052, P = 0.052; 根: RANOSIM = -0.062, P = 0.63; adj-R2 CAP = 0.005, P = 0.303) (图2A, B)。因此，AM共生是维持正常根内和根际微生物区系所必需的。
我们进一步在ASV水平分析了共生对根际菌群的影响。与野生型WT相比，我们观察到，WT与共生突变体的根际细菌群落中共有85个ASVs的绝对丰度发生了显著变化(图2C)，而根细菌群落中有52个ASVs的绝对丰度发生了显著变化(补充图5)。值得注意的是，我们发现与WT相比，有20种ASV 的绝对丰度在M-突变体(dmi2，dmi3，pt4)的根际土壤中均显著下降，其中9种为根瘤菌目细菌(图2C)。我们还观察到其中5个ASV的绝对丰度在M-突变体的根际土壤中显著增加，在M+R-突变体的根际土壤中也有所增加(图2C)，表明这5个ASV受到两种共生类型的调节。综上所述，植物的AM共生功能缺陷对M. truncatula根-土壤界面中的细菌群落绝对丰度有显著影响，主要反映在根际根瘤菌目进化枝中细菌类群的数目下降。
图2 在自然土壤中正常的根迹相关微生物群的组装需要AM共生
(A)和(B) 使用基于Bray-Curtis距离主坐标约束排序分析(CAP) 显示根际(A) 和根样品(B) 中定量细菌类群在不同共生植物基因型中的变化; (C) 与野生型WT相比，共生突变体根际土壤中发生变化的85种细菌ASVs的热图和系统发育树。
AM共生影响根瘤菌目在根际微生物共发生网络中的核心地位
AM Symbiosis Impacts Rhizobiales-Hubs in the Bacterial Co-abundance Network1
基于QMP数据集中ASVs之间的显著相关性(Spearman相关性检验, PFDR < 0.05)，分析了细菌共发生网络。结果表明，在WT和M+R-植物根际(ipd3-1、nfp-1和lyk3-1)中，有38.6%共发生网络的边与属于根瘤菌目的细菌互作(图3A)。这表明根瘤菌目细菌可能是形成AM共生的植物根际微生物网络中的核心微生物类群。在不能形成AM共生的植物的根际微生物网络中，只有33.8％与ASVs相互作用的边缘属于根瘤菌目（图3B）。此外，相对于M-根际微生物共发生网络，在M+根际中观察到了根瘤菌目ASVs更高的度中心性(degree centrality)（图3C）。
根瘤菌目ASVs也被鉴定为M+植物根中微生物共发生网络中的主要集群，而Actinomycetales和Xanthomonadales ASVs则作为M-根中微生物共发生网络中的主要集群（图3D-F）。此外，与M+植物（图3D; 节点264; 边线3520; 连通性0.46）相比，M-植物（图3E; 节点300; 边线4705; 连通性0.59）的根微生物共发生网络显示出更高的连通性。
图3 AM共生影响根瘤菌目细菌在根际定量微生物共发生网络中的核心地位
(A-B)基于M+ (A)和M- (B) 植物根际土壤中16S rRNA基因的QMP数据集，配对的ASVs之间Spearman相关性的共发生网络; (C) M+和M-植物根际微生物共发生网络中不同细菌目的中心度差异; (D-E)基于M+ (D)和M- (E) 植物根中16S rRNA基因的QMP数据集，配对的ASVs之间Spearman相关性的共发生网络; (F) M+和M-植物根中微生物共发生网络中不同细菌目的中心度差异。
AM共生促进根际中根瘤菌的积累
AM Symbiosis Promote the Accumulation of Rhizobia in the Rhizosphere
为了进一步测定AM共生对根瘤菌类群的潜在影响并克服16S rRNA分析中识别细菌物种的局限性（16S rRNA无法定种），我们通过对rpoB基因进行测序特异性地定量了根瘤菌种群的绝对丰度。 rpoB高通量测序总共鉴定出56种共生根瘤菌rpoB ASVs，属于16种已有记录的豆科植物的根瘤菌种，其中Rhizobium anhuiense (55.0％) 和Pararhizobium giardinii (14.9％)在根际中占主导地位，而S. medicae (55.1％)和R. anhuiense (21.1％)在根中占主导地位。
图S8 共生根瘤菌不同种群在WT和共生相关突变体根际及根中的绝对丰度
有趣的是，与WT或M+R-突变体相比，M-突变体的根际土壤中的根瘤菌rpoB序列的决定丰度显着降低(Kruskal Wallis, PFDR <0.05) (图4A)。与WT相比，M-突变体的根际土壤中R. anhuiense, P. giardinii 和 Bradyrhizobium japonicum的绝对丰度显著下降(Kruskal Wallis, PFDR <0.05) (图4B)。出乎意料的是，苜蓿根中的根瘤菌rpoB序列数在植物不同共生基因型之间没有显著性差异，即使在根瘤菌共生缺陷突变体中(补充图9)。
为了测试非豆科植物中是否也发生了AM共生引起的根瘤菌积累，我们还定量了三种玉米自交系的根际土壤中AM真菌 VTs和根瘤菌的绝对丰度。确实，我们发现在AM定殖率较高的玉米品系的根际土壤中，根瘤菌rpoB序列的总丰度(补充图11B)和P. giardinii, S. adhaerens, S. meliloti的丰度(补充图11C)明显更高。这些结果表明AM共生促进根瘤菌在根际中的积累。
图4 AM共生促进蒺藜苜蓿根际中根瘤菌积累和自然土壤中根瘤菌-豆科植物有效结瘤
(A) 植物不同基因型根际根瘤菌rpoB序列的绝对丰度; (B) 在不同植物基因型的根际中，14种根瘤菌种的热图和系统发育树; (C) 在自然土壤中生长两个月后苜蓿根部有效红色根瘤的数量; (D) 在无菌蛭石条件下生长的WT和pt4植物根部上有效红色瘤的数量 (接种根瘤菌S. meliloti Rm2011或S. medicae RS90，OD600 = 0.001);
(E) 豌豆，菜豆和大豆接种1ml 10-5稀释的非根际土壤，WT，lyk3，dmi3和pt4根际土壤样品后的结瘤百分比
AM共生促进根际定殖的根瘤菌种群可以促进不同豆科植物结瘤
The AM-Promotion of Microbial Communities in the Rhizosphere promotes Nodulation in Different Legumes
为了测定蒺藜苜蓿根际中AM共生促进的根瘤菌积累是否影响自然土壤中的根结瘤，我们测定了野生型和突变植物的根瘤数。与已发布的数据一致，lyk3，nfp，dmi2和dmi3突变体没有形成根瘤，而ipd3在其根部形成了小的白色凸起。有趣的是，与野生型植物(4.3±1.36; 均值±SD)相比，只有25％的pt4突变体(0.4±0.90)在自然土壤中形成有效瘤(Fisher exact test, P = 0.0003)，但100％的pt4突变体可以在无菌蛭石中接种根瘤菌后出现有效瘤(S. meliloti Rm2011, 5.4±1.91; S. medicae RS90, 6.24±2.22; OD = 0.001) (Fisher exact test, P = 1; 图4C和D)。由于从未报道过pt4突变体在实验室条件下的结瘤被影响，因此我们重新检查了这些植物以及ram1突变体（该突变体只影响菌根信号转导，在结瘤信号转导中没有作用）的根瘤。与上述结果一致，所有野生植物(6.4±4.72)均在自然土壤中形成有效瘤，但在pt4中没有结瘤，在ram1植物中仅观察到一个有效瘤(补充图12)。这些植物的丛枝菌根表型(补充图12)与Glomeromycota 18S rRNA基因调查的结果一致(图1A)，M- (dmi2, dmi3, pt4和ram1)植物均未形成任何有效丛枝菌根。这些数据表明，在自然土壤中，由于AM共生而促进的根瘤菌积累可能反过来促进了蒺藜苜蓿的结瘤。
为了分析AM共生促进的蒺藜苜蓿根际微生物群落对于自然土壤中的豆科植物结瘤是否重要，我们分析了四种豆科植物的结瘤现象。具体而言，我们用来自蒺藜苜蓿WT和突变植物(lyk3, dmi3和pt4)稀释的根际微生物群落接种了蚕豆，豌豆，菜豆和大豆。研究发现，蚕豆植物全部没有结瘤。对于其他三类豆科植物，与WT植物相比，接种M- (pt4和dmi3)植物的稀释根际微生物群落导致每株植物的有效瘤数显著减少(图4E, Kruskal Wallis, PFDR <0.05< span="">)。总的来说，在根瘤菌贫瘠的自然土壤中，AM共生植物促进的根瘤菌在根际土中的积累可能会促进后续豆科植物的结瘤固氮。
讨论
Discussion
该研究发现菌根共生缺陷显著降低了细菌微生物群——根瘤菌目尤为明显——在植物根际的增殖，并改变了根际及根内微生物组的种群结构。基于微生物共发生网络分析发现根瘤菌目的细菌在菌根共生正常的植物根际中处于核心地位，菌根共生的缺失影响了该网络的稳定性。该研究进一步通过根瘤菌rpoB基因和AM真菌SSU rRNA基因的高通量测序和微生物群定量研究了根际微环境中AM共生与根瘤共生之间的相互作用，发现AM共生可以促进多种共生根瘤菌种群在根际的增殖。最后，根际微生物群回接研究表明，AM共生影响的微生物群落可以促进自然土壤中不同豆科植物结瘤。该研究表明，豆科植物与根瘤菌共生关系的建立是植物-根瘤菌-环境三者相互作用的结果，AM真菌庞大的菌丝网络在给植物提供营养的同时，也帮助植物根系富集根瘤菌，促进豆科植物与根瘤菌的共生。该研究从根际层面揭示了丛枝菌根共生与根瘤共生在植物适应陆地环境过程中的协同进化。
参考文献
Wang X., Feng H., Wang Y., Wang M., Xie X., Chang H., Wang L., Qu J., Sun K., He W., Wang C., Dai C., Chu Z., Tian C., Yu N., Zhang X., Liu H., and Wang E. (2021). Mycorrhizal Symbiosis Modulates the Rhizosphere Microbiota to Promote Rhizobia-Legume Symbiosis. Mol. Plant. doi: https://doi.org/10.1016/j.molp.2020.12.002.
第一作者简介
王孝林，博士。2013年于江南大学生物工程学院获学士学位；2018年于中国农业大学生物学院获博士学位；2018年至今在中科院分子植物科学卓越创新中心从事博士后工作。目前主要研究方向为微生物生态和植物微生物组，千种植物微生物组计划的主要负责人之一。近年主要研究成果以第一作者或微生物组数据负责人在Nature、Molecular Plant、Science Bulletin 和Soil Biology and Biochemistry等杂志发表过论文。
通讯作者简介
王二涛，博士，研究员，博士生导师，“国家杰出青年基金”获得者, 2020年科学探索奖获得者。2003年于河南大学获学士学位；2008年于中国科学院研究生院获博士学位；2008-2012年在英国John Innes Centre从事博士后研究；2013年至今，任中国科学院上海植物生理生态研究所研究员。主要从事豆科植物-根瘤共生固氮，植物-丛枝菌根真菌共生方面的研究。建立植物-丛枝菌根真菌共生营养交换的新理论模型；揭示豆科植物根瘤发生的分子调控机理等。研究成果以通讯作者发表在Science, Nature, Molecular Plant, The Plant Cell和Cell Research等国际主流学术期刊上，对植物-微生物共生领域有重要影响。
刘欢, 深圳华大生命科学研究院助理院长&数字化地球研究所所长，农业基因组学国家重点实验室副主任，国家重点研发计划课题负责人，华南农业大学客座教授，野生动植物基因保护国家创新联盟秘书长，主要从事基因组学及系统生物学研究。近年来在 Nature Plants, Genome Biology, Giga Science 等 SCI 期刊发表 30 多篇，其研究成果两次被 Nature Plants 期刊选为研究亮点发表评论文章；申请专利 25 项,其中授权 9 项；主持及参与政府科研项目 14 项，主持 2 项，联合主持 1 项；参编著作 2 本。
张学斌，博士，教授，博士生导师。2005于山西农业大学获学士学位；2008年于英国诺丁汉大学获理学博士学位；2008-2011年在英国Rothamsted Research从事博士后工作；2011-2018就职于美国Brookhaven National Laboratory。现任河南大学生命科学学院教授。主要从事植物苯丙素类化合物合成途径调控和F-box基因家族功能解析方面的研究。在Nature Communications, Plant Biotechnology, The Plant Cell，Plant Physiology，Molecular plant， Biochemical Journal，FEBS letter等国际知名学术期刊发表研究论文。
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