利用宏基因组揭示丛枝菌根真菌通过增强菌丝际微生物组的磷循环功能来提高植物磷吸收

导读：

在自然和农田系统中，丛枝菌根（AM）真菌的根外菌丝定殖着不同的细菌，但AM真菌与菌丝际微生物组相互作用影响土壤有机磷活化的机制仍不清楚。我们通过双分室试验，以模式植物蒺藜苜蓿为研究材料，在菌丝室中设置磷添加处理（不加磷，以KH₂PO₄或难溶性植酸盐的形式添加磷）。我们通过宏基因组测序研究了土壤磷循环的微生物组功能特征。结果表明，与土体土壤相比，AM真菌菌丝际形成了特定的土壤微生物组，并改变了土壤微生物组的磷转化功能。基因组分箱的结果表明，AM真菌招募了同时含多个gcd基因和phoD基因拷贝的物种，这协同驱动了菌丝际土壤中难溶性植酸盐的活化。我们的结果表明，AM真菌招募了一个特定的菌丝际微生物组，并改变了它们的磷循环功能，以提高土壤中植酸盐的利用。这项研究首次通过宏基因组揭示了菌丝际微生物组的磷循环功能特征，有助于加深我们对菌丝际微生物互作和有机磷活化机制的认识。

论文ID

题目：Arbuscular mycorrhizal fungi enhance plant phosphorus uptake through stimulating hyphosphere soil microbiome functional profiles for phosphorus turnover

译名：丛枝菌根真菌通过强化菌丝际微生物组的磷循环功能提高植物磷吸收

期刊：New Phytologist

五年IF: 10.768

发表时间：2023.01

第一作者：Guiwei Wang（王桂伟）；Zexing Jin（靳泽星）

通讯作者：张林 副教授

作者单位：中国农业大学资源与环境学院, 国家农业绿色发展研究院

原文链接：

https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.18772也可点击左下方阅读原文跳转

与根际微生物组相似，AM真菌菌丝际也定殖着独特的微生物组，称为AM真菌的第二基因组，在菌根途径的营养获取中发挥重要作用，尤其对促进植物菌根途径加强土壤有机磷利用具有重要意义。然而，菌丝际微生物磷活化的功能特征仍然不清楚。植酸是磷酸单酯的一种重要形式，约占土壤有机磷总量的20%。本研究旨在研究菌丝际微生物组及其功能对土壤植酸盐活化的影响，了解哪些微生物基因参与了这一过程，并量化其对菌根途径磷吸收的影响。我们有以下假设：（1）菌丝际土壤微生物促进了植物对植酸盐的吸收利用；（2） 在菌丝际土壤中，多种功能基因参与了土壤植酸盐的活化过程；（3）菌丝际土壤微生物组对AM真菌菌丝分泌物具有利用偏好，AM真菌增强了菌丝际微生物的磷循环功能。

试验设计

试验设计

利用根盒隔网分室培养体系（图S1），本试验为双因素随机区组设计：

（1）菌丝室设3个磷形态，不加磷、磷酸二氢钾、植酸钙；

（2）两个AM真菌水平，接种或不接种Rhizophagus intraradices MUCL 43194。

土壤经γ射线灭菌所有处理菌丝室均接种5 mL土壤细菌滤液。

图S1试验装置图

结果与讨论

1.菌根响应度、碱性磷酸酶活性、Olsen有机磷、细菌16S rRNA基因拷贝数和phoD基因拷贝数

我们首先研究了接种AM真菌和添加磷对植物磷吸收和菌丝际土壤磷循环的影响。AM真菌和磷添加之间的相互作用显著影响地上部磷浓度和磷含量（表S1）。总的来说，与不添加磷处理相比，在菌丝室中添加KH₂PO₄能显著提高苜蓿的菌根响，而与添加植酸盐的处理没有显著差异（图1a，b）。接种AM真菌显著提高了菌丝室土壤碱性磷酸酶活性（表S1；图1c）。与不添加磷和添加KH₂PO₄的处理相比，添加植酸盐的处理表现出最大的碱性磷酸酶活性。与不接种AM真菌的处理相比，在菌丝室中添加植酸盐并接种AM真菌的处理中，土壤碱性磷酸酶活性是不接种处理的1.7倍（图1c）。向菌丝室中添加植酸盐能够显著提高土壤Olsen有机磷，接种或不接种AM真菌的处理没有显著变化（表S1；图1d）。双因素分析的结果表明，添加磷而不是接种AM真菌（表S1）能够显著影响16S rRNA基因拷贝数。在不接种AM真菌处理中向菌丝室中添加植酸盐，16S rRNA基因拷贝数显著增加（图1e）。然而，在菌丝室中添加植酸盐，不接种和接种AM真菌处理之间16S rRNA基因拷贝数没有显著差异。当在菌丝室中添加植酸盐时，与不接种处理相比，接种AM真菌处理中的phoD基因拷贝数显著增加（图1f）。仅当在菌丝中添加植酸盐时，不接种处理和接种处理之间phoD基因拷贝数存在显著差异。

图1植物和土壤指标

2.细菌群落组成

我们研究了不同磷添加下菌丝际的细菌群落组成及其特征。PCA结果表明得出的PC1和PC2解释了54%的方差。在属水平上，添加植酸盐处理的细菌组成与CK和添加KH₂PO₄处理有明显的分离（图2a）。当在菌丝室中添加植酸盐时，不接种AM真菌处理的细菌群落也明显与接种AM真菌处理分离。相对丰度直方图显示，在属水平上Sphingoaurantiacus相对丰度最高，其次是Gemmatimonas, Microvirga, Candidatus_Nitrososphaera, Streptomyces,Ramlibacter, Lysobacter,unclassified_Burkholderiaceae and Gemmatirosa（图2b）。与不加磷和添加KH₂PO₄的处理相比，添加植酸盐处理Lysobacter的相对丰度最高。添加植酸磷并接种AM真菌显著提高了Gemmatimonas和Streptomyces的相对丰度（5.11%-6.23%和3.68%-5.27%）。在ASV水平上，ASV的相对丰度受到AM真菌和不同磷添加的显著影响（图2c）。AM真菌富集了分别属于Ramlibacter, unclassified_Micrococcaceae, Cupriavidus, Streptomyces, Aridibacter,Gemmatimonas, uncultured, JG30-KF-CM45和Candidatus_Nitrocosmicus的11个ASV，但降低了15个ASV的相对丰度。

图2不同处理下菌丝际微生物组成特征

3.土壤磷循环的微生物基因相对丰度及基因共生网络

我们通过宏基因组测序分析了参与土壤磷循环的微生物基因，研究了菌丝际土壤微生物组的功能。参考KEGG数据库，在菌丝室土壤中检测到三类磷循环基因基因，即磷饥饿反应调控、磷活化以及磷吸收和转运（图3；表1）。接种AM真菌对土壤磷循环中多数基因的总相对丰度没有显著影响（P>0.05）（图3a）。与不添加磷和添加KH₂PO₄处理相比，添加植酸盐处理显著增加了编码phoD、gcd和pstS基因的相对丰度，但降低了upgBAEC, TC.PIT, phnA和phnX基因的相对丰度（图3b）。总的来说，当苜蓿接种AM真菌时，参与土壤磷循环基因的总相对丰度没有显著影响（图S4）。而与不添加磷处理相比，添加植酸盐显著增加了参与磷活化的微生物基因的总相对丰度，但降低了参与磷吸收和转运的微生物基因总相对丰度。

图3不同处理下土壤磷循环功能基因特征

我们通过土壤磷循环的不同微生物功能基因之间建立了五个基因互作网络（表1；图4）。选择了参与土壤磷循环的共生微生物基因的网络拓扑特性，如平均程度、节点数、边缘密度、连接数和模块等，以表征接种AM真菌和添加磷对土壤微生物功能基因互作网络的影响（图4；表S4）。与添加KH₂PO₄和植酸盐处理相比，不加磷处理的共现网络结构最复杂（图4）。与不加磷处理相比，添加植酸盐明显减少了大多数基因的连接数，如gcd、phnF、phnC、phnM、phnI和phnJ（图4）。模块性用于测量划分为模块的网络强度。当苜蓿接种AM真菌后，基因网络的模块性增加（图4；表S4）。具体而言，接种AM真菌的功能基因互作网络具有5个模块和166个连接数，而不接种AM真菌处理的功能基因网络具有9个模块和188个连接数（图4f；表S4）。与不接种处理相比，接种AM真菌处理明显减少了phnN、phoD、phnC、pstS、TC.PIT、appA、pit、upgA和phoP的链接数量，但增加了gcd、phoR、phnK、ppaX、ugpB和pstC的连接数量（图4）。

图4功能基因共发生网络

4. gcd和phoD基因的细菌基因组分箱和群落组成

我们研究了细菌基因组库和总体群落组成，以表征菌丝际土壤微生物组促进磷活化的潜在能力。基因组完整性超过80%的153个细菌基因组的系统发育分布属于14个门（图5a）。在153个细菌基因组箱中，68个基因组箱含有gcd或phoD基因拷贝。有一个细菌基因组bin，即bin2.39，属于变形杆菌，分别含有四个gcd基因拷贝和两个phoD基因拷贝（图5a）。与不加磷和添加KH₂PO₄处理相比，当接种AM真菌并添加植酸盐显著增加了基因组bin2.39的相对丰度，而不接种AM真菌磷添加处理之间没有显著差异（图5b）。当在菌丝室中添加植酸盐时，接种AM真菌也显著增加了含有一个phoD基因拷贝的基因组bin2.97。此外，接种AM真菌和添加磷改变了含有gcd和phoD基因的细菌群落组成（图S5）。当菌丝室中添加植酸盐时，该属的相对丰度在不接种AM真菌和接种AM真菌之间没有显著差异（图S5a）。而在接种AM真菌处理中，含有phoD基因的Actinomadura和Noviherbaspirillum,的相对丰度分别显著增加了0.8倍和2.3倍（图S5b）。

图5基因组分箱及其相对丰度

5. 基因组bins、磷循环相关基因相对丰度与碱性磷酸酶活性的相关性

我们使用Spearman相关分析建立了bin2.39、bin2.97、pqq、gdh、gcd、phoD和土壤碱性磷酸酶活性的相对丰度之间的相关性，这代表了不同水平下土壤磷活化的关系（图6；图S6）。碱性磷酸酶活性与bin2.39（P<0.001）、bin2.97（P=0.008）、gcd（P=0.001）和phoD（P=0.006）基因的相对丰度呈显著正相关。phoD基因相对丰度与bin2.39（P=0.025）、bin2.97（P=0.031）和gcd（P=0.0013）基因相对丰度呈显著正相关。gcd基因的相对丰度与bin2.39（P＜0.001）、bin2.97（P＜0.01）和pqq（P＝0.0013）基因的相对含量呈显著正相关。

图6不同指标之间的相关性

6.土壤微生物呼吸、CAZy基因的相对丰度和微生物代谢途径

我们使用葡萄糖、果糖、海藻糖和肌醇作为底物研究了土壤微生物对不同碳源的利用偏好，以反映菌丝际土壤微生物组对AM真菌分泌物的代谢特性（图7a）。当葡萄糖或肌醇添加到土壤样品中时，土壤呼吸（CO₂产生）速率受到AM真菌和磷添加之间的相互作用的显著影响（表S1）。当不接种AM真菌时，添加KH₂PO₄和植酸盐处理之间的土壤呼吸速率没有显著差异，接种AM真菌并添加植酸盐后，葡萄糖能够显著提高土壤呼吸速率（图7a）。在不添加磷的情况下，向土壤样品中添加果糖时，与不接种AM真菌处理相比，接种AM真菌处理的土壤呼吸速率显著增加（P=0.043）（图7a）。向土壤样品中添加海藻糖时，与不接种AM真菌处理相比，添加植酸盐并接种AM真菌的土壤呼吸速率显著增加（P=0.006）（图7a）。当不接种AM真菌时，不同磷添加处理之间的土壤呼吸速率没有显著差异，而在接种AM真菌并添加植酸盐的处理中，肌醇的添加显著刺激了呼吸速率（图7a）。前20个丰富的CAZy基因（图7b）被分类为糖苷水解酶（GHs）、糖基转移酶（GTs）和碳水化合物结合模块（CBMs）。添加植酸盐处理具有最大的CAZy基因总相对丰度（图S7）。菌丝室中不加磷时，与不接种处理相比，当接种AM真菌时，CAZy基因的总丰度显著降低（图S7）。具体而言，接种AM真菌处理中GT4、GT2、GH0、CBM50、GH2和GT35基因的相对丰度显著低于不接种处理（图7b）。此外，接种AM真菌处理显著增加了碳水化合物-氨基代谢和消化吸收的代谢途径，而与不接种处理相比，当在菌丝室中添加植酸盐时，淀粉和蔗糖代谢没有显著差异（图S8）。

图7不同处理土壤微生物呼吸及CAZy基因相关丰度

讨论

植物如何整合自身和第二基因组，即招募微生物组从土壤中获取养分，是我们理解植物生物学和生态学的重要前沿。AM真菌的根外菌丝也定殖着微生物组，在菌根途径对植物养分吸收的贡献中起重要作用。在本研究中，我们首次结合高通量和宏基因组测序揭示了菌丝际微生物组的组成和循环功能特征。重要的是，我们发现AM真菌与其菌丝际微生物组之间的相互作用促进了难溶性植酸盐的活化，并提高了苜蓿菌根途径的磷吸收。

1. 菌丝际土壤-微生物相互作用增加了苜蓿通过菌根途径对磷的吸收

在自然和农业生态系统中，植物-微生物和微生物-微生物之间的相互作用在促进植物的营养吸收和健康方面发挥着重要作用（Zhou et al., 2020；Xu et al., 2022）。先前的研究表明，植物-AM真菌-细菌系统直接影响菌根途径的磷贡献（Wang et al., 2022；Zhou et al., 2022）。然而，很少有文献研究AM真菌及其第二基因组（即菌丝际土壤微生物组）如何相互作用以影响菌根途径的植物磷吸收效率。在本研究中，我们重点研究了AM真菌和土壤细菌群落在土壤有机磷活化中协同作用背后的基因组机制。我们发现当AM真菌菌丝存在于菌丝际土壤中时，碱性磷酸酶活性显著增加。特别是，在菌丝际中添加植酸盐时，土壤碱性磷酸酶活性提高了71.8%。一般而言，碱性磷酸酶活性的增加可能归因于携带编码磷酸酶基因（例如phoD基因）的细菌数量增加或细菌群落结构的明显变化。我们发现当在菌丝室中添加植酸盐时，在AM真菌菌丝存在的情况下，phoD基因拷贝数显著增加，这可能会促进植酸磷的水解。此外，我们还发现接种AM真菌和添加植酸盐对菌丝际微生物组有显著影响。一些属于Streptomyces and Gemmatimonas的ASV被报道为通过产生碱性磷酸酶的细菌（Zhang et al., 2018a；Guo et al., 2019），当添加植酸盐时，AM真菌富集了这些ASV。然而，需要在纯培养中分离这些细菌并研究其功能特征支持这一假设。此外，我们还发现了AM真菌改变了含有phoD基因的细菌群落。由于菌丝际土壤中碱性磷酸酶活性的增加，我们发现当在菌丝室中添加植酸盐时，AM真菌和菌丝际土壤微生物组之间的相互作用通过菌根途径增强了植物对磷的吸收。重要的是，当添加植酸盐时，菌根植物具有与添加KH₂PO₄处理相似的地上部磷浓度和含量。总之，上述结果表明AM真菌与菌丝际微生物组相互作用促进了土壤有机磷的活化，提高了苜蓿对磷的吸收。

2. 破解菌丝际土壤中与碱性磷酸酶活性相关功能基因的特征

有一系列基因参与土壤磷循环，可以调控土壤植酸盐的活化（Berkemper et al., 2016；Dai et al., 2020）。然而，AM真菌和菌丝际微生物组之间的相互作用活化土壤植酸盐的过程仍不清楚。在本研究中，宏基因组学提供了更全面的数据，包括菌丝际土壤中可培养和不可培养的有机磷矿化微生物。首先，当土壤磷受到限制时，参与磷饥饿反应调节的基因，如phoB、phoP、phoR和phoU等将被触发（Eder et al., 1996；Hsieh and Wanner, 2010；Dai et al., 2020）。phoP基因直接调节phoD基因的表达（Guo et al., 2018；Zeng et al., 2022）。在本研究中，与不添加磷相比，添加植酸盐显著降低了phoP基因的相对丰度。有趣的是，当在菌丝室中添加植酸盐时，phoD基因的相对丰度显著增加，且AM真菌显著增加了phoD基因拷贝数，这促进了植酸盐的矿化。其次，植酸盐的添加削弱了一些参与磷吸收和转运的基因（如phoR、gcd和pstABCS）在基因网络中的作用，而AM真菌削弱了phoD基因在互作网络中的的作用，但强化了gcd基因在基因网络的作用。微生物网络复杂性有助于预测生态系统的多功能性，并反映了微生物的磷同化能力（Dai et al., 2020）。磷循环基因的发生网络表明，AM真菌和植酸盐的添加都降低了网络的复杂性，这表明通过接种AM真菌或添加磷可能使微生物磷循环基因网络的功能向功能特异性转移（图4）。第三，土壤微生物释放的碱性磷酸酶通常由phoD基因编码，这意味着phoD基因的相对丰度与碱性磷酸酶活性呈正相关（Sakurai et al., 2008）。在本研究中，碱性磷酸酶活性与phoD基因的相对丰度显著相关，这证明了phoD基因在促进菌丝际土壤碱性磷酸酶活性中的潜在作用。总之，这表明一系列基因的协调可能是碱性磷酸酶活性增加的重要驱动因素之一。

3. gcd基因在菌丝际土壤有机磷活化中的关键作用

难溶性植酸盐的活化不仅取决于碱性磷酸酶活性，还取决于酶的底物可用性。在本研究中，我们向菌丝际土壤中添加了难溶性植酸盐，即植酸钙。它应该首先被羧酸盐螯合，成为可溶的植酸盐。土壤微生物产生的葡萄糖酸在溶解不溶性植酸盐中起着重要作用（Elias et al., 2001）。具体而言，葡萄糖被位于细胞质膜外的葡萄糖脱氢酶氧化为葡萄糖酸（Elias et al., 2001；Krishnaj and Goldstein, 2001；Sashidhar和Podile, 2010）。还涉及由葡萄糖脱氢酶（由gdh基因编码）和辅因子吡咯喹啉醌（由pqq基因编码）组成的醌蛋白葡萄糖脱氢酶（由gcd基因编码）。先前的研究更关注植酸盐的水解，但忽略了菌丝际生物相互作用如何影响难溶性植酸盐的溶解过程（Zhang et al., 2022）。例如，含有phoD或bpp基因的微生物组与AM真菌菌丝相关，在增强菌丝际土壤中的植酸盐活化方面发挥了重要作用，这意味着AM真菌的根外菌丝招募产生碱性磷酸酶或BPP的细菌群落，以补偿AM真菌中缺失的植酸盐活化功能（Zhang et al., 2018a；Wang et al., 2019；Zhang et al., 2020）。然而，很少有研究报道在菌丝际生物互作过程中gcd基因溶解难溶性植酸盐的作用。在这里，我们观察到phoD基因的相对丰度显示出与gcd基因的显著相关性。这表明，通过葡萄糖酸的增溶，碱性磷酸酶可以更有效地水解植酸盐，以向土壤溶液中释放无机磷（Tabatabai and Bremner, 1969；Sakurai et al., 2008）。此外，我们重组了68个微生物基因组，并在菌丝际土壤中发现了含有gcd基因或phoD基因的微生物群落。有趣的是，我们发现AM真富集了细菌基因组bin2.39，当在菌丝室中添加植酸盐时，该基因组同时含有gcd和phoD基因。尽管当向土壤中添加植酸盐时，接种AM真菌处理中基因组bin 2.39的相对丰度仅为不接种处理的1.52倍，但由于存在多个磷活化功能基因拷贝，磷活化的潜在功能可能会大大提高。这表明AM真菌招募了具有活化土壤有机磷能力的细菌物种。因此，gcd基因和phoD基因在AM真菌和菌丝际土壤微生物组之间的相互作用中发挥了关键作用，促进了土壤植酸盐的活化。

4. AM真菌根外菌丝招募具有对菌丝分泌物代谢偏好的微生物组

与根系分泌物的作用类似，AM真菌的菌丝分泌物可以形成特定的菌丝际细菌群落，并强化其在磷活化中的功能（Zhang et al,. 2016；Emmett et al., 2021）。在本研究中，我们首先通过评估CAZymes编码基因，分析了菌丝际土壤微生物组的腐生能力。我们发现，添加植酸盐显著增强了土壤微生物组的腐生能力，但AM真菌存在削弱了腐生能力。GHs、GTs和CBMs基因（如GH13、GT4、GT2、GH0、CBM48、GT51和GH3）的相对丰度因AM真菌的存在而降低。其次，我们使用AM菌丝分泌物中检测到的主要化合物（如葡萄糖、果糖和海藻糖）（Bharadwaj et al., 2012；Zhang et al., 2018c）来研究菌丝际微生物组的代谢偏好。结果表明，当添加植酸盐的土壤与葡萄糖和海藻糖一起培养时，AM真菌的存在显著增加了土壤的呼吸速率，这表明AM真菌分泌物中的葡萄糖和海藻糖可能在解磷细菌的招募中起重要作用。第三，当在菌丝室中添加植酸盐时，AM真菌存在显著增加了碳水化合物消化和吸收中代谢途径的相对丰度，而不是淀粉和蔗糖代谢。先前的研究表明，AM真菌菌丝的分泌物可能是被动渗出过程上游发生的靶向反应，而不是纯粹的被动过程（Kaiser et al., 2015）。因此，当在菌丝室中添加植酸盐时，AM真菌的根外菌丝可以吸引对菌丝分泌物具有代谢偏好的微生物组，这可能与磷活化的功能有关。未来，研究应量化相关基因拷贝数或使用转录组测序来全面了解菌丝际微生物组的代谢特征。

结论

总的来说，我们的研究了AM真菌和菌丝际微生物组之间的相互作用对土壤植酸盐活化的影响和机制（图8）。我们发现，与土壤磷循环相关的菌丝际微生物组的群落结构和功能分布受到AM真菌的显著影响。同时，植酸盐活化与phoD基因编码的碱性磷酸酶活性的增加无关，但受gcd基因丰度的影响。AM真菌富集了含有gcd和phoD基因的微生物基因组bin 2.39和含有phoD基因。因此，在苜蓿-AM真菌-菌丝际微生物组共生体系中，难溶性植酸盐的活化是多基因和菌丝际土壤中微生物多样性的协同过程（图8）。我们的研究结果加深了对AM真菌与菌丝际土壤微生物相互作用过程的理解，以提高植物对土壤有机磷的利用，并为集约农业生产中微生物潜力的开发和土壤磷素的高效利用提供了科学依据。

图8菌丝际微生物互作模式图